Cosa è un One Step RT-qPCR Master Mix: guida completa

Vuoi sapere cosa è un One Step RT-qPCR Master Mix? Per prima cosa è necessario approfondire alcuni aspetti fondamentali

Innanzitutto, partiamo da cosa è un master mix per PCR. Non è altro che una soluzione concentrata e premiscelata al cui interno ci sono tutti i componenti utili per la razione PCR in tempo reale.

Generalmente, ci sono una DNA polimerasi termostabile, dNTP, MgCl2 e additivi proprietari in un tampone ottimizzato per la PCR.

Successivamente, bisognerà aggiungere solamente il modello, i primer, le sonde e l’acqua. In alcuni casi, potrebbe essere sufficiente utilizzare dei coloranti per rilevare la formazione del prodotto in tempo reale.

Cosa è un One Step RT-qPCR Master Mix

I reagenti One-Step sono utili perché consentono di amplificare i campioni di RNA sulla PCR master mix. Infatti, devi sapere che le fasi di trascrizione inversa (RT) e qPCR sono effettuate nello stesso pozzetto.

Pertanto, ciò contribuisce a ridurre il numero di manipolazioni del campione per poter ottenere lo stesso risultato.

Il processo di RT-PCR che coinvolge un’unica fase è utilizzata per elaborare più campioni alla volta. Ad esempio, vengono utilizzate per effettuare delle rilevazioni dei virus, screening dell’espressione genica e altri esperimenti su RNA.

Scelta di un master mix per PCR

Perché scegliere un master mix per PCR? Questo apparecchio è molto importante perché consente di utilizzare meno pipettaggio, riduce la contaminazione, offre una minore variabilità da provetta a provetta. Insomma, garantisce risultati più riproducibili.

Queste macchine vengono utilizzate per una serie di applicazioni. Stiamo parlando della quantificazione dell’espressione genica, genotipizzazione e altro. Ci sono una serie di fattori da considerare quando si acquista una master mix per PCR. Ad esempio, potresti verificare il tipo di PCR, la complessità del modello, la velocità, la scalabilità, tolleranza agli inibitori e tanto altro.

Considerazioni sulla miscela master per PCR

In generale, le considerazioni principali per la scelta di una master mix PCR per la PCR in tempo reale sono l’applicazione, il tipo di campione e la sequenza target. Poi, ci sono anche due approcci fondamentali per misurare la formazione del prodotto in una PCR: i saggi basati su sonde e i coloranti leganti il DNA a doppio filamento.

Partendo da quest’ultimo, il colorante più comune è sicuramente il SYBR® Green I. Un altro che si può utilizzare in maniera alternativa è EvaGreen.

Quali sono le differenze tra queste due opzioni? La principale diversità tra uno e l’altro sono i limiti di saturazione. Il primo è un colorante non saturante; il secondo è un colorante saturante. Ciò consente di utilizzare EvaGreen per applicazioni di fusione ad alta risoluzione.

Devi sapere che alcuni sistemi di qPCR adottano anche un colorante di riferimento passivo in maniera tale da consentire una normalizzazione della variazione di fluorescenza non PCR. Uno dei più diffusi coloranti passivi è il ROX.

Infine, è importante sottolineare come ci siano diversi DNA polimerasi che sono disponibili nelle miscele master PCR. Da cosa dipende la scelta di queste diverse opzioni? Bisogna considerare aspetti come il tipo di campione, la sequenza target, la velocità richiesta.

Fonti:
https://www.thermofisher.com/it/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-reagents/one-step-real-time-rt-master-mix.html
https://www.bio-rad.com/featured/en/pcr-master-mix.html