Anticorpi secondari

Avrete sentito parlare molto di anticorpi secondari, i coniugati di anticorpi secondari sono strumenti importanti negli studi biochimici e cellulari. Gli anticorpi marcati con un enzima, come i secondari HRP, hanno un alto tasso di rotazione catalitica e sono usati abitualmente in vari saggi grazie alla loro rapida e robusta generazione di segnali. Gli anticorpi secondari HRP sono stati ampiamente utilizzati nei saggi immunosorbenti legati all’enzima (ELISA), nei saggi a flusso laterale (LFA), nell’immunoistochimica (IHC) e nel Western blotting per la diagnosi delle malattie infettive. Gli anticorpi coniugati con coloranti fluorescenti forniscono segnali più brillanti e capacità di multiplexing in applicazioni di analisi cellulare e proteica, compresa la microscopia a immunofluorescenza e l’imaging cellulare.

Le caratteristiche più importanti degli anticorpi secondari marcati con enzimi e coloranti sono l’alta sensibilità e l’amplificazione del segnale.

Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari e sono spesso utilizzati per rilevare e visualizzare un anticorpo primario, che è legato alla sua proteina di interesse, in applicazioni come l’immunoblotting o l’immunocitochimica.

Diversi anticorpi possono legarsi allo stesso anticorpo primario, aumentando la sensibilità e amplificando il segnale. Gli anticorpi sono spesso coniugati a molecole indicatrici, enzimi come HRP o fluorofori come APC, per permettere la rilevazione fluorescente, colorimetrica o chemiluminescente degli anticorpi primari.

La specie dell’anticorpo secondario dipende dalla specie ospite dell’anticorpo primario utilizzato. Gli anticorpi sono sviluppati contro una classe o sottoclasse di immunoglobuline di una specie specifica.

Un anticorpo secondario si lega a un anticorpo primario che si lega direttamente all’antigene bersaglio. Dopo che la regione V di un anticorpo primario si lega all’antigene, un anticorpo secondario marcato lega la sua regione V alla regione madre o C dell’anticorpo primario.

Sfruttando questa azione reciproca, gli anticorpi possono aiutare indirettamente a rilevare e purificare le proteine bersaglio (antigeni).

Gli anticorpi secondari sono più sensibili e flessibili nell’etichettatura e nella rilevazione e sono quindi utilizzati nella rilevazione colorimetrica, chemiluminescente e fluorescente degli anticorpi primari in una serie di applicazioni, come la citometria a flusso, il western blotting e l’imaging cellulare.

La selezione del tipo di anticorpo secondario si basa sulla classe dell’anticorpo primario – immunoglobulina IgG o IgM – sul tipo preferito di etichetta scritta e sull’ospite di origine.

Anche se la maggior parte degli anticorpi primari sono sviluppati utilizzando alcune specie dell’ospite di origine e la maggior parte degli anticorpi primari appartengono alla classe IgG, i produttori offrono spesso anticorpi secondari pronti all’uso che possono essere utilizzati in molte procedure e sistemi di rilevamento diversi.

Esempi di anticorpi di uso comune sono anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG, anti-chicken IgG o anti-goat IgG.

L’anticorpo secondario selezionato deve sempre essere in grado di riconoscere la specie in cui l’anticorpo primario è stato prodotto, ad esempio per rilevare un anticorpo primario prodotto da un topo, un anti-topo del computer genitore viene utilizzato come anticorpo secondario.

L’anticorpo secondario ottimale per un saggio specifico dipende anche dal tipo di scrittura dell’etichetta.

QUALI SONO I MIGLIORI ANTICORPI SECONDARI?

La maggior parte degli anticorpi primari sono prodotti in ospiti di topo o coniglio; pertanto, le IgG anti-topo e le IgG anti-coniglio sono i tipi di anticorpi più popolari. La capra è la specie ospite più facilmente e frequentemente utilizzata dai produttori per produrre anticorpi secondari policlonali anti-mouse e anti-rabbit.

A COSA SERVONO GLI ANTICORPI SECONDARI?

Gli anticorpi secondari aiutano a rilevare, smistare e purificare gli antigeni target. Per consentire la rilevazione, questi devono avere specificità per la specie di anticorpo e l’isotipo dell’anticorpo primario utilizzato e sono solitamente coniugati.

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Anticorpi secondari

Gli anticorpi secondari forniscono il rilevamento e l’amplificazione del segnale oltre ad estendere l’utilità di un anticorpo attraverso la coniugazione alle proteine e sono particolarmente adatti per l’immunomarcatura. Si legano agli anticorpi primari che sono direttamente legati all’antigene bersaglio. Gli anticorpi secondari trovano applicazione in diversi tipi di analisi come immunoistochimica, Western Blot, citometria a flusso ed ELISA. La selezione degli anticorpi secondari dipende interamente dalla classe degli anticorpi primari, dal tipo di etichetta e dall’ospite di origine. La maggior parte degli anticorpi primari appartiene alla classe IgG e sono generati in un insieme comune di specie ospite come pollo, coniglio, capra, topo, ecc. Quindi la nomenclatura corretta sarà IgG anti-capra, IgG anti-pollo, IgG anti-coniglio. Solitamente vengono utilizzati IgG anti-topo o anticorpi policlonali. Una conoscenza adeguata del test di rilevamento è quindi necessaria per identificare l’anticorpo secondario ottimale. cioè i test ELISA e Western blot possono essere eseguiti utilizzando il sistema reporter a fluorescenza, il sistema chemiluminescente e colorimetrico mentre la citometria a flusso e l’immunofluorescenza sono solitamente limitate alle etichette reporter fluorescenti. In tutte queste tecniche è necessario un anticorpo secondario coniugato.

(i): Gli anticorpi secondari forniscono il rilevamento e l’amplificazione del segnale iniziale, accrescendo l’efficacia di un anticorpo attraverso la coniugazione con le proteine antigeniche.

Questa funzione si espleta allorché gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari che, a loro volta, già si sono  direttamente legati all’antigene bersaglio.

Grazie a queste caratteristiche sono utilizzati nell’immunomarcatura.

Cosa sono gli anticorpi secondari

Per definire correttamente cosa siano gli anticorpi secondari, è opportuno procedere con ordine definendo quali siano le differenze con gli anticorpi primari.

Innanzitutto, cominciamo con il dire che gli anticorpi sono proteine ​​o immunoglobuline, prodotte dalle plasmacellule, che hanno la capacità di individuare e neutralizzare gli antigeni, che sono molecole estranee potenzialmente dannose per l’organismo.

Nella struttura dell’anticorpo è presente una porzione, nota come “paratopo”, che identifica e si lega alla struttura complementare dell’antigene che è nota come “epitopo”.

Nel momento in cui un anticorpo si lega ad un antigene, attiva altre risposte immunitarie, come l’azione dei macrofagi per distruggere l’agente patogeno estraneo.

Gli anticorpi primari sono prodotti come anticorpi policlonali e monoclonali.

Questi anticorpi sono utili a scopo di ricerca per rilevare biomarcatori per malattie come il diabete, il cancro, il morbo di Alzheimer e la malattia di Parkinson.

In funzione del meccanismo con cui un anticorpo si lega ad un antigene (direttamente o indirettamente), possiamo distinguere tra “anticorpi primari” e “anticorpi secondari”: mentre un anticorpo primario ha la capacità di legarsi direttamente all’antigene, un anticorpo secondario non si lega direttamente all’antigene, ma sviluppa le interazioni attraverso il legame intermedio con l’anticorpo primario.

Questa è, sinteticamente, la differenza di fondo tra un anticorpo primario e quello secondario.

Modalità di funzionamento di un anticorpo secondario

Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari per facilitare il rilevamento e l’amplificazione degli antigeni oggetto della risposta immunitaria.

Gli anticorpi secondari hanno l’importantissima caratteristica di non interferire con la procedura di legame degli anticorpi primari con gli antigeni, in quanto non si legano direttamente all’antigene: allorché gli anticorpi primari si siano legati direttamente agli antigeni bersaglio, gli anticorpi secondari intervengono e, a loro volta, si legano agli anticorpi primari.

Dato un anticorpo primario ottenuto dal siero di animali (topo/ratto/ coniglio/capra) a seguito dell’inoculazione della proteina di interesse, per utilizzare gli anticorpi secondari occorre usare il siero di un animale, di una specie diversa da quella in cui è stata indotta la produzione degli anticorpi primari, a sua volta immunizzato con anticorpi della specie dell’anticorpo primario: per dirlo semplicemente, se l’anticorpo primario è stato prodotto in un coniglio, l’anticorpo secondario deve essere prodotto, ad esempio, in una capra immunizzata contro il siero di coniglio.

Gli anticorpi secondari sono, quindi, anticorpi diretti contro la parte costante di un anticorpo di specie diversa

L’anticorpo secondario deve essere specifico per le specie di anticorpi e per l’isotopo dell’anticorpo primario durante l’attività di rivelazione dell’antigene.

Il tipo di anticorpo secondario è selezionato dalla classe di anticorpi primaria, dall’organo di origine e dall’etichetta proteica.

La maggior parte delle classi di anticorpi primari sono di classe IgG.

A cosa servono gli anticorpi secondari

Gli anticorpi secondari, particolarmente efficaci nell’immunomarcatura sono utilizzati in vari tipi di test come ELISA o Western Blotting, Flow Cytometry e Immunohistochemistry, ecc.

Infatti, gli anticorpi secondari forniscono il rilevamento e l’amplificazione del segnale oltre ad estendere l’utilità di un anticorpo attraverso la coniugazione con le proteine.

Gli anticorpi secondari sono tendenzialmente disponibili in forme coniugate.

Per le tecniche come ELISA o Western Blotting, è tendenzialmente più diffuso l’utilizzo di secondari coniugati con enzima, mentre per la citometria di flusso o l’immunofluorescenza vi è una preferenza per gli anticorpi secondari coniugati a proteine fluorescenti o coloranti come Alexa Fluor.

Nell’immunomarcatura, poiché è necessario un solo tipo di anticorpo secondario per legarsi a molti tipi di anticorpi primari, ciò riduce il costo in quanto è sufficiente etichettare un solo tipo di anticorpo secondario, piuttosto che vari tipi di anticorpi primari.

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