Real Time PCR

KIT Real Time PCR

La PCR real-time (conosciuta anche come qPCR, ovvero Quantitative PCR, da non confondere con RT-PCR) è un metodo che simultaneamente amplifica e quantifica il DNA. Il DNA è amplificato da reazioni a catena della DNA-polimerasi. Dopo ogni turno di amplificazione, il DNA è quantificato. È richiesto l’utilizzo di colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio-filamento e gli oligonucleotidi modificati del DNA che sono fluorescenti una volta ibridati con un DNA. 

Le tecniche che si occupano di amplificare e rilevare gli acidi nucleici sono sicuramente tra le più importanti nel campo della ricerca biologica. Questi metodi vengono applicati in vari modi per capire il livello qualitativo dell’acido nucleico oppure in termini quantitativi. 

Quindi, la PCR in tempo reale è un processo che può essere utilizzato per affrontare un’analisi quantitativa e qualitativa. Tuttavia, richiede un’ampia conoscenza di questa tecnologia. 

Ecco perché abbiamo deciso di fornire una breve panoramica di cosa è la PCR in tempo reale e delle sue tecniche più utilizzate. 

Fornisce inoltre suggerimenti per le fasi di isolamento dell’RNA come la raccolta del campione, l’estrazione dell’RNA e l’analisi della qualità e della quantità di RNA.

Che cos’è la PCR in tempo reale?

Nella PCR convenzionale, il prodotto del DNA amplificato viene rilevato in un’analisi del punto finale. Nella PCR in tempo reale, l’accumulo del prodotto di amplificazione viene misurato man mano che la reazione progredisce, in tempo reale, con la quantificazione del prodotto dopo ogni ciclo.

Quindi, per prima cosa, le reazioni di amplificazioni vengono definite con reagenti PCR e primer unici. Successivamente, queste reazioni vengono eseguite in strumenti di PCR in tempo reali e vengono raccolti dei dati. 

Il rilevamento in tempo reale dei prodotti della PCR è reso possibile dall’inclusione di una molecola reporter fluorescente in ciascun pozzetto di reazione che produce una maggiore fluorescenza con una quantità crescente di DNA prodotto. Le sostanze chimiche di fluorescenza impiegate a questo scopo includono coloranti che legano il DNA e primer o sonde specifici per sequenza marcati in modo fluorescente. 

Uno dei principali vantaggi di utilizzare la PCR in tempo reale è che consente di capire qual è il numero iniziale di copie di DNA con estrema precisione. 

Come detto, i risultati ottenuti da una PCR in tempo reale possono essere sia quantitativi che qualitativi. La prima è definita anche analisi qPCR. 

I dati della qPCR in tempo reale hanno modo di essere valutati anche senza l’utilizzo di elettroforesi su gel. Ciò consente di aumentare sensibilmente la produttività del processo. 

Infine, poiché le reazioni qPCR in tempo reale vengono eseguite e i dati vengono valutati in un sistema qPCR unificato a tubo chiuso, le opportunità di contaminazione sono ridotte e la necessità di manipolazione di postamplificazione viene eliminata nell’analisi qPCR.

Applicazioni di PCR/qPCR in tempo reale

PCR/qPCR in tempo reale rappresentano uno degli strumenti più importanti e più diffusi per determinare la velocità di quantificazione rapida e sensibile dell’acido nucleico. Ciò avviene in diverse applicazioni come: l’analisi dell’espressione genica, il rilevamento di organismi geneticamente modificati negli alimenti e la fenotipizzazione del cancro .

I qPCR sono anche utilizzati per misurare in termini quantitativi il numero di copie geniche che si sono trasformate in seguito alla presenza di geni mutanti. Possono essere utilizzati per quantificare con precisione i cambiamenti nell’espressione genica, ad esempio un aumento o una diminuzione dell’espressione in risposta a diverse condizioni ambientali o al trattamento farmacologico, misurando i cambiamenti nell’espressione cellulare livelli di mRNA.