TUNEL Assay – Frammentazione del DNA e Apoptosi
TUNEL Assay – Frammentazione del DNA e Apoptosi
L’ apoptosi è il processo di morte intracellulare programmata che comporta cambiamenti morfologici e biochimici caratteristici che progressivamente portano a morte cellulare [1]. Per le cellule, il fallimento di uno di questi step che avvengono nell‘ apoptosi è un evento comune nella formazione di molti tumori [2], per questa ragione lo studio del processo di apoptosi e dei meccanismi che la inducono è di importanza particolare per la ricerca sul cancro che necessita quindi di appositi metodi di identificazione.
Un tratto distintivo del processo tardivo di apoptosi è la frammentazione del DNA che genera una moltitudine di rotture del doppio filamento (double-strand breaks – DSBs) rendendo accessibili i gruppi 3’-idrossi. Questa caratteristica costituisce un valido punto di partenza per metodi di identificazione dell’apoptosi come il Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) [3].
Questa tecnica permette di rilevare DNA frammentato attraverso il labeling del residuo terminale degli acidi nucleici. Viene comunemente usato per rilevare DNA frammentato risultante dalla cascata di attivazione dell’apoptosi e si basa sulla presenza di rotture nella sequenza di DNA che possono essere rese evidenti grazie all’uso di terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), un enzima che catalizza l’aggiunta di dUTP, successivamente evidenziabile con un marker. Questo metodo può inoltre evidenziare cellule che hanno subito un danno al DNA severo.
Figura 1: Il principio del saggio TUNEL si fida all’aggiunta di dUTP (X-dUTP) modificato alle estremità 3’-OH del DNA che hanno subito rotture a causa dell’induzione dell’apoptosi. Questa reazione si deve all’attività dell’enzima terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). Per evitare la perdita di DNA frammentato e per facilitare l’entrata dell’enzima e dei nucleotidi, occorre che le cellule si fissano prima della reazione di labeling. Il desossiUTP bromoilato (BrdUTP) che è stato incorporato si rileva tramite la coniugazione con un’anticorpo specifico legato a un’enzima reporter oppure un colorante fluorescente (A). Il desossiUTP contenente alchini (EdUTP) si visualizza via una reazione di tipo alchino-azide tra l’EdUTP e un fluoroforo contenente un gruppo azidico, catalizzata da Cu(I) (B).
Il saggio TUNEL identifica le cellule apoptotiche attraverso l’inserimento di nucleotidi marcati (X) desossiUracile trifosfato (X-dUTPs) mediato dall’enzima terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) alle estremità 3’-OH del DNA che hanno subito rotture. Questi nick possono essere successivamente visualizzati a seconda del marcatore inserito (Fig. 1), fornendo un parametro sulla percentuale di cellule apoptotiche all’interno della popolazione cellulare analizzata.
La sensibilità del saggio dipende in larga misura dall’efficienza di inserimento dei nucleotidi marcati, e dal marcatore utilizzato (dimensioni e ingombro sterico). Un gran numero di dUTP modificati sono disponibili (marcatori fluorescenti, biotinilati, digossigenilati) e sono buoni substrati dell’enzima TdT, ma dUTP contenenti marcatori di dimensioni inferiori come bromurati (BrdUTP) o alchino-coniugati (EdUTP) hanno mostrato una maggiore efficienza di inserimento e quindi producono saggi di elevata sensibilità nei saggi TUNEL, probabilmente dovuto al minore ingombro sterico dei marcatori [3,4,5].
Mentre l’inserimento di BrdUTP è identificabile da anticorpi specifici legati a fluorofori specifici o ad enzimi reporter (Fig. 1A), la rivelazione con EdUTP si ottiene chimicamente attraverso coniugazione covalente di un fluoroforo contenente azide in un processo catalizzato da ioni Cu monovalenti (CuAAC) (Fig. 1B).
I nostri TUNEL Assay kit:
| 5-Bromo-dUTP (5Br-dUTP) | 5-Ethynyl-dUTP (5-EdUTP) | |||||||
| Prodotto | Codice | Quantità | Prezzo (EUR) | Prodotto | Codice | Quantità | Prezzo (EUR) | |
| S pack | NU-122S | 50 Units | 138,00 | S pack | CLK-T07-S | 0,5 µmol | 144,00 | |
| L pack | NU-122L | 5 x 50 Units | 346,00 | M pack | CLK-T07-M | 2,5 µmol | 488,00 | |
| L pack | CLK-T07-L | 5 µmol | 717,00 | |||||
Bibliografia e riferimenti
[1] Kerr et al. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26(4):239.
[2] Lowe et al. (2000) Apoptosis in Cancer. Carcinogenesis 21(3):485.
[3] Darzynkiewicz et al. (2008) Analysis of apoptosis by cytometry using TUNEL assay. Methods 44(3):250.
[4] Li et al. (1995) Labelling DNA strand breaks with BrdUTP: Detection of apoptosis and cell proliferation. Cell proliferation 28(11):571.
[5] Li et al. (1995) Single–step procedure for labeling DNA strand breaks with fluorescein- or BODIPY-conjugated deoxynucleotides: Detection of apoptosis and bromdeoxyuridine incorporation. Cytometry 20:172.
