Cas9 Nuclease and Nickase

Informazioni generali – Sistema di gene editing CRISPR / Cas9

Lo strumento sviluppato più recentemente nel campo delle endonucleasi RNA-guidate è costituito dal sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9 che permette di modificare ampi tratti di genoma tramite rottura e sostituzione, in modo specifico. Attraverso una sequenza target-specifica di RNA-guida a singolo filamento (sgRNA), la nucleasi Cas9 svolgerà il duplex di DNA genomico e cliverà la sequenza di entrambi i filamenti in seguito a riconoscimento. La conseguente rottura del doppio filamento viene richiusa attivando la ricucitura delle estremità non omologhe (NHEJ), distruggendo l’open reading frame del gene target. Il Sistema CRISPR / Cas9 è superiore sia per efficacia che per efficienza ad altri strumenti di editing genomico, quali il Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs). La frequenza di ricombinazione omologa con il Sistema CRISPR / CAS9 è quattro volte maggiore rispetto a TALENs, e il targeting biallelico ha una efficienza con CRISPR / Cas9 tre volte maggiore.

Applicazioni:

• CRISPR Generazione di linee cellulari personalizzate con knockout stabile
• CRISPR Libreria personalizzata di Targeted Lentiviral sgRNA

Cas9, uno strumento flessibile e versatile per il genome editing

Il sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9 permette di eliminare e rimpiazzare in modo specifico qualunque sequenza genomica. Questo sistema robusto e semplice richiede la coespressione di due componenti principali distinte: una esonucleasi, Cas9 e una sequenza di RNA guida di tipo target-specifico (gRNA). L’espressione di Cas9 nella cellula target o ospite è conseguita attraverso trasfezione con vettori retrovirali, trasduzione in lentivirus, o trasduzione in adenovirus. Cas9 svolgerà il duplex di DNA e cliverà entrambi I filamenti in seguito a riconoscimento della sequenza target da parte di gRNA. La risultante rottura a doppio filamento viene riparata dal meccanismo di riparo delle estremità non omologhe (NHEJ), distruggendo l’open reading frame del gene target e causando un frameshift e/o inserendo un codone di stop precoce.

Homology Directed Repair (HDR) con la nucleasi Cas9
In aggiunta al meccanismo NHEJ, le cellule possono realizzare il riparo del DNA anche attraverso Riparo diretto per omologia (Homology Directed Repair – HDR), che può essere sfruttato per introdurre modifiche ai nucleotidi della sequenza genomica di DNA. Un DNA stampo per il meccanismo di riparo contenente la sequenza che si desidera inserire può essere normalmente introdotto con trasfezione nelle cellule insieme a gRNA / Cas9 e deve avere un elevato grado di omologia con la sequenza immediatamente a monte e a valle della rottura nel doppio filamento.

Cas9 Nickase per ricombinazione omologa e specificità
La nucleasi Cas9 è stata modificata in un enzima “nickase” in modo che uno dei suoi domini catalitici sia inattivo, realizzando delle rotture a singolo filamento invece che il taglio della doppia elica a livello della sequenza target nel DNA genomico. Questa modifica riduce gli effetti sul target nel caso in cui la sequenza di RNA-guida riconosca e si leghi in modo aspecifico una sequenza non desiderata di DNA, dato che non una, ma due gRNA devono essere localizzate a breve distanza (<20 nucleotidi) su filamenti opposti del DNA genomico per avere la rottura del doppio filamento desiderata. Una rottura a singolo filamento in uno dei due strand può essere più facilmente riparata dal sistema di riparo per omologia (HDR) usando l’altro filamento intatto come stampo.

L’enzima Cas9 Nickase può anche essere utilizzato per creare una rottura nel singolo filamento di DNA genomico per poi introdurre modifiche ai nucleotidi tramite ricombinazione omologa, se lo stampo di DNA contenente le modifiche desiderate viene trasfettato nelle cellule insieme al gRNA / Cas9.

	Richiesta di gRNA	InDels indotte?	HDR indotte?	Applicazioni suggerite
Cas9 Nuclease	Un gRNA per ogni target	Sì, molto efficiente	Sì	InDel, HDR (se il target errato non è un caso problematico)
Cas9   Nickase	Un gRNA per ogni target	Scarsamente rilevabile	Sì, efficienza minore	HDR senza generare InDel
Cas9   Nickase	Due gRNA per ogni target	Sì, molto efficiente	Sì	InDel, HDR (quando è fondamentale evitare target aspecifici, maggiore accuratezza)