Il Southern blotting è una tecnica fondamentale in biologia molecolare. Fu inventata per la prima volta da E.M. Southern nel 1975 come un importante metodo per trasferire molecole di DNA, specialmente frammenti di restrizione, da un gel per elettroforesi a un foglio di nitrocellulosa o di nylon, solitamente chiamato membrana.
Durante il processo, il modello di banda di DNA presente nel gel viene replicato sulla membrana. Dopo il post-trattamento, il DNA è immobilizzato sulla membrana e può essere usato come substrato per l’analisi di ibridazione con sonde di DNA o RNA etichettate che hanno come target i singoli frammenti di restrizione nel DNA blottato.
Lo scopo del pretrattamento è quello di rompere le molecole di DNA in bande individuali all’interno del gel in frammenti più piccoli, poiché i frammenti più piccoli vengono trasferiti più velocemente di quelli più grandi. Pertanto, il gel viene prima immerso in 0,25mol L-1 HCL per 30 minuti. In secondo luogo, viene eseguito un pretrattamento con una soluzione alcalina per denaturare le molecole di DNA a doppio filamento, rompendo i loro legami idrogeno in modo che diventino a filamento singolo. Questo aiuta anche il loro trasferimento e il successivo legame alla membrana. Inoltre, assicura che, dopo il legame, i componenti di base-accoppiamento dei polinucleotidi siano disponibili per l’ibridazione alla sonda.
L’elettroforesi su gel è una tecnica della scienza biologica. I gel sono usati per separare tutti i tipi di molecole, compreso il DNA. Il gel di agarosio è il più comunemente usato nell’analisi meridionale.
È un polisaccaride che forma una matrice sciolta quando viene riscaldato con acqua. Un pezzo di agarosio viene riscaldato e preparato riscaldando circa 1g di polvere di agarosio in 100ml di soluzione salina composta da 40mM-Tris-acetato, 1mM-EDTA, pH 8.0. La miscela calda viene poi versata in uno stampo rettangolare e lasciata riposare. Un formatore di pozzetti è posto ad un’estremità per produrre piccole fessure nel gel. Il gel viene poi posto in una vasca speciale con elettrodi alle due estremità e completamente immerso nella soluzione salina. Il DNA pretrattato con l’enzima di restrizione viene posto nelle scanalature e la vasca è collegata a un alimentatore che fornisce un’alimentazione elettrica controllata per guidare l’elettroforesi. I frammenti di DNA hanno una carica negativa, quindi iniziano a migrare attraverso il gel verso il terminale positivo. Alla fine, i frammenti di DNA sono distribuiti in una corsia del gel con i frammenti più grandi ad un’estremità e i frammenti più piccoli all’altra. È importante identificare qualsiasi frammento di DNA con una mutazione che potrebbe seriamente compromettere la vita di un feto.
Per rimuovere il DNA dal gel, un pezzo di sottile materiale filtrante di nitrocellulosa viene posto sul gel seduto su uno stoppino imbevuto nella soluzione salina. Una pila di carta assorbente è posta sopra il filtro e un peso è posto sopra. Il peso preme sulla pila e la soluzione salina comincia a muoversi verso l’alto attraverso il gel e sulla carta assorbente mentre tira i frammenti di DNA. I frammenti aderiscono alla superficie del filtro. Questo viene fatto per alcune ore per assicurare che tutto il DNA venga lavato via dal gel. Durante questa tecnica, si ottiene un filtro che ha tutto il DNA originariamente nel gel attaccato ad esso nella forma esatta in cui era mentre era all’interno del gel. Così, la procedura assomiglia alla cancellazione di una firma d’inchiostro, da cui il termine Southern Blotting.
In un’altra tecnica, come il trasferimento sotto vuoto, il DNA viene rimosso dal gel sotto vuoto e posto su un materiale filtrante estremamente resistente, fatto di nylon, ma meno fragile della nitrocellulosa. Il filtro di nylon è efficace nel legare il DNA così come i frammenti di DNA, in modo che siano possibili molte analisi diverse del DNA legato. Tuttavia, con questa tecnica non è facile determinare se ci sono o meno mutazioni nel gene del DNA.
