CometAssay – Elettroforesi su Gel a Singola Cellula (SCGE)

L‘  Elettroforesi su Gel a Singola Cellula (SCGE) o CometAssay

è una tecnica per quantificare il danno al DNA e la capacità di riparo del DNA genomico per campioni in vitro e in vivo di cellule eucariotiche e di alcune cellule procariotiche. Abbinato al nuovo sistema CometAssay Electrophoresis System, che elimina le cause note che determinano variabilità in questo saggio, è l’unica tecnica nota capace di misurare direttamente il danno al DNA per cellule isolate e in forza di questo ha rapidamente guadagnato importanza nel campo della genotossicità e biomonitoraggio umano e ambientale.

Applicazioni:

• Applicabile all’analisi di rotture a singolo e a doppio filamento a carico del DNA
• Studio della risposta cellulare in seguito a danno al DNA
• Screening di inibitori del meccanismo di riparo del DNA
• Test di agenti chimici potenzialmente tossici
• Screening di mutageni ambientali
• Sperimentazione di tipi particolari di danno al DNA utilizzando diverse DNA-glicosilasi di riparo

1. Cellule mescolate con Agarosio a basso punto di ebollizione alla temperatura di 37^oC (LM Agarose)
2. Cellule immobilizzate su supporto CometSlide
3. Trattamento delle cellule con Lysis Solution (rimuove le membrane cellulari e nucleari, rimuove anche gli istoni associati al DNA)
4. Campioni trattati con basi (svolgimento e denaturazione del DNA)
5. Campioni marcati con coloranti intercalanti e visualizzati al microscopio ad epifluorescenza dopo elettroforesi alcalina, che rivela le rotture al filamento di DNA

CometAssay Kit

Catalogo	Descrizione	Quantità
4250-050-K	CometAssay® Kit (25 X 2 well slides)	50 campioni
4252-040-K	CometAssay® Kit (2 X 20 well slides)	40 campioni
4253-096-K	CometAssay® Kit (1 X 96 well slide)	96 campioni

Il CometAssay, detto anche Elettroforesi su Gel a Singola Cellula (SCGE) fornisce un metodo semplice ed efficace per valutare il danno al DNA cellulare. I principio del saggio si basa sull’abilità dei frammenti di DNA denaturato e clivato di migrare a partire dal nucleoide seguendo il campo elettrico, mentre il DNA non danneggiato migra più lentamente e rimane nei confini del nucleoide se viene applicato un flusso di corrente elettrica. La valutazione della “coda a forma di cometa” e del pattern di migrazione permette di stabilire se e quanto il DNA è danneggiato. Il Neutral CometAssay è tipicamente utilizzato per rilevare rotture al doppio filamento, mentre Alkaline CometAssay è più sensibile ed è frequentemente adottato per rilevare danni di modesta entità con rotture sia a singolo che a doppio filamento.

Protocollo del saggio Alkaline Comet:

Step 1:  Le cellule sono mescolate con agarosio low melting, immobilizzate su un apposito supporto e poi lisate.

• Membrane e istoni sono rimossi per lasciare solo il DNA delle singole cellule isolate

Step 2: I campioni sono trattati con basi per svolgere e denaturare il DNA.

• Per rilevare rotture a singolo e a doppio filamento

Step 3: Dopo elettroforesi alcalina i campioni sono colorati con marcatori per DNA e visualizzati al microscopio a fluorescenza.

• Un aumento del danno al DNA determina un aumento nel numero di piccolo frammenti di DNA genomico che migrano più velocemente in campo elettroforetico
• Misura quantitativa del danno al DNA

Componenti del kit acquistabili anche separatamente:

Catalogo	Componente/ Quantità
4250-010-01	CometAssay Lysis Solution / 100 ml
4250-050-01	CometAssay Lysis Solution / 2 x 500 ml
4250-050-02	CometAssay LMAgarose / 15 ml
4250-050-03	CometSlides (2 Well, 25, Slides) / 25 each
4250-050-04	200 mM EDTA, pH 10 / 12.5 ml
4252-040-01	CometAssay® HT Slides (20 Well, 2 Slides) / 2 slides
4253-096-03	CometSlide™ (96 Well) / 1 slide

CometAssay Electrophoresis System II

CometAssay ES II permette a tutti i ricercatori di ottimizzare in modo affidabile e riproducibile l’alkaline e il neutral comet test, standardizzando l’elettroforesi tra singoli utenti e tra diversi laboratori. I vostri Comet assay possono variare in relazione alla temperatura, la distanza tra gli elettrodi, l’altezza del livello di tampone. Noi abbiamo risolto questi problemi sviluppando questa speciale unità per elettroforesi.

Catalogo	Descrizione	Quantità
4250-050-ES	CometAssay Electrophoresis System II	1 system

Caratteristiche:

• Mantiene costante la temperatura del tampone grazie al sistema di raffreddamento integrato e al corpo unico in plastica fusa
• Mantiene il livello ottimale di tampone garantendo risultati consistenti e riproducibili
• Le griglie appositamente disegnate possono alloggiare supporti con 2, 20 e 96 pozzetti mantenendoli nella corretta posizione durante l’elettroforesi
• Ottimizzato per l’uso con CometAssay Kits e CometAssay Control Cells
• Disponibile con alimentatore area-specifico

CometAssay Control Cells

Trevigen ha sviluppato due serie di sospensioni cellulari contenenti diversi livelli noti di danni al DNA pronti all‘uso come controlli per il CometAssay Kit sia per alkaline che per il neutral comet, rispettivamente. Questi controlli criopreservati sono ideati per funzionare da controlli per standardizzare e confrontare i risultati dei comet assay tra utenti diversi e anche tra diversi laboratori.

Caratteristiche:

• Fornisce un intervallo di diversi gradi di danno al DNA per confronto con popolazioni statisticamente distinte di cellule
• Permette di standardizzare il metodo di elettroforesi rendendolo indipendente dall‘utente che lo usa
• Standardizzato con CometAssay Electrophoresis System
• Le popolazioni cellulari rimangono stabili in azoto liquido per il mantenimento in tempi lunghi

Catalogo	Descrizione	Quantità
4256-010-CC	CometAssay Alkaline Control Cells	10 saggi
4257-010-NC	CometAssay Neutral Control Cells	10 saggi

CometAssay Alkaline Control Cells
Una popolazione di cellule sane (CC0) trattata per aumentare gradualmente il numero di rotture a singolo filamento nelle popolazioni CC1, CC2 e CC3, rispettivamente.
CometAssay Neutral Control Cells
Una popolazione di cellule sane (NC0) trattata per aumentare gradualmente il numero di rotture del doppio filamento nelle popolazioni NC1, NC2 e NC3, rispettivamente.