Notizie : test PCR attivati dalla luce
Nell’ultimo anno ci sono stati molti sviluppi e novità intorno ai test PCR, in questi giorni è emerso un nuovo approccio da parte dei chimici della LMU che potrebbe aiutare a migliorare notevolmente i test diagnostici basati sulla PCR. Gli enzimi utilizzati sono attivati da impulsi di luce.
Le DNA polimerasi e altri enzimi che modificano il DNA sono strumenti essenziali nella biotecnologia e nella diagnostica. Sono il componente chiave per la diagnosi PCR di COVID-19. Per quanto siano utili, gli enzimi di elaborazione del DNA hanno spesso difetti significativi. Alcuni di essi mostrano un’attività significativa durante la preparazione del campione, mentre altri hanno spiacevoli attività collaterali. Entrambi possono portare alla perdita di specificità e sensibilità, che dovrebbe essere evitata in un test diagnostico.
Il trucco è quello di bloccare qualsiasi tipo di attività enzimatica fino all’inizio del test. Nel caso di test diagnostici basati sulla test PCR, come il già citato test COVID-19, la soluzione è lo sviluppo di un enzima hot-start, che non mostra attività fino al raggiungimento di un’elevata temperatura di attivazione. Lo svantaggio principale di questi metodi hot-start è che non possono essere utilizzati per gli enzimi che sono danneggiati dal calore, dice il biochimico della LMU Andrés Vera. “Inoltre, il layout di un enzima hot-begin è noioso e il laborioso metodo di layout deve essere ripetuto per ogni nuovo enzima che dobbiamo impaginare”.
Insieme a Merve-Zeynep Kesici, del gruppo del professor Philip Tinnefeld del Dipartimento di Chimica della LMU, Andrés ha trovato un modo per aggirare questi problemi progettando enzimi a partenza rapida. I suoi enzimi che si avviano alla luce sono bloccati fino a quando un impulso di luce ultravioletta li riattiva. “Gli enzimi controllati dalla luce esistono da molto tempo, ma ciò che rende unico il nostro approccio è che può essere applicato praticamente a qualsiasi enzima di elaborazione del DNA. In passato, si aveva sempre bisogno di informazioni molto dettagliate su come funziona l’enzima, e inoltre non si era in alcun modo positivo se si può fornire un modo intelligente per arginare l’enzima e riattivarlo con la luce”, dice Vera, il leader dell’impresa.
Nel loro approccio, i ricercatori hanno attaccato un pezzo di DNA all’enzima stesso, che compete eccessivamente con qualsiasi altro substrato enzimatico, rendendo effettivamente l’enzima inattivo (comprese le sue attività secondarie).
L’impulso di luce viene utilizzato per tagliare il DNA legato all’enzima, ottenendo un enzima attivo al 100%. Il vantaggio principale è che il meccanismo dovrebbe funzionare per una vasta gamma di enzimi legati al DNA, indipendentemente dalla loro specifica modalità di azione.
Per dimostrarlo, i ricercatori hanno prodotto quattro versioni attivabili dalla luce di diversi enzimi di elaborazione del DNA. Tra questi c’era la cosiddetta DNA polimerasi Phi29, un enzima ampiamente utilizzato per amplificare interi genomi, ma troppo sensibile al calore per essere adatto ai metodi di avvio a caldo. Inoltre, il team ha dimostrato la light-start PCR e ha dimostrato che le loro DNA polimerasi erano altrettanto buone o migliori rispetto agli enzimi commerciali hot-start PCR.
Philip Tinnefeld accoglie con favore questo nuovo sviluppo: “Questo aiuterà sicuramente a produrre enzimi migliori per uso biotecnologico e diagnostico. Inoltre, le macchine esistenti per la PCR in tempo reale già incorporano fonti di luce e potrebbero essere facilmente modificate per portare questi enzimi sul mercato in qualsiasi momento.
