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Western blot (Immunoblot): elettroforesi su gel delle proteine

Il Western blotting, o immunoblotting, è una tecnica analitica usata in biologia cellulare e molecolare per identificare proteine specifiche in una miscela complessa di proteine, come quelle presenti negli estratti di cellule o tessuti. La tecnica utilizza tre fasi per ottenere questo risultato: separazione per dimensioni, trasferimento su un supporto solido e, infine, visualizzazione. mediante marcatura delle proteine con l’uso di appropriati anticorpi primari o secondari.

Western blot Cosa rileva?

Il Western blotting è una tecnica di laboratorio utilizzata per rilevare una specifica proteina in un campione di sangue o di tessuto. Il metodo prevede l’uso dell’elettroforesi su gel per separare le proteine dal campione. Le proteine separate vengono trasferite dal gel alla superficie di una membrana. La membrana viene esposta a un anticorpo specifico contro la proteina in studio. Il legame dell’anticorpo viene rilevato usando un marcatore radioattivo o chimico. Un Western Blot è talvolta usato per diagnosticare una malattia.

Western blot (Immunoblot): elettroforesi su gel delle proteine

Il Western blotting (chiamato anche immunoblotting) è una tecnica utilizzata per l’analisi di singole proteine in una miscela di proteine (ad esempio un lisato cellulare).

Nel Western blotting (immunoblotting) la miscela di proteine viene applicata a un’elettroforesi su gel su una matrice di supporto (SDS-PAGE, native PAGE, focalizzazione isoelettrica, elettroforesi su gel 2D, ecc.) per ordinare le proteine in base alle dimensioni, alla carica o ad altre differenze nelle singole bande proteiche.

Le bande proteiche separate vengono poi trasferite su una membrana di supporto (ad esempio nitrocellulosa, nylon o PVDF). Questo processo è chiamato blotting. Le proteine aderiscono alla membrana nello stesso schema in cui sono state separate a causa delle interazioni di carica.

Le proteine in questo immunoblot sono quindi accessibili per il legame degli anticorpi per il rilevamento.

Gli anticorpi sono utilizzati per rilevare le proteine target nel western blot (immunoblot). Gli anticorpi sono coniugati a etichette o enzimi fluorescenti o radioattivi che danno luogo a una successiva reazione con un reagente applicato, risultante in una colorazione o emissione di luce che permette la rilevazione.

Il termine Western Blotting si basa su un gioco di parole. Il Southern blotting, che è un metodo per rilevare specifiche sequenze di DNA, prende il nome da Ed Southern, che fu il primo a descrivere questa procedura.

Il western blot (immunoblot), così come il northern blot (per la rilevazione dell’RNA), giocano sul significato di questo nome.

Western blot Elettroforesi su gel

Cos'è l'elettroforesi del gel proteico?

L’elettroforesi del gel è una tecnica usata per separare frammenti di DNA (o altre macromolecole, come RNA e proteine) in base alle dimensioni e alla carica. L’elettroforesi comporta l’applicazione di una corrente attraverso un gel contenente le molecole di interesse. In base alla loro dimensione e carica, le molecole si muoveranno attraverso il gel in direzioni diverse o a velocità diverse, separandole così le une dalle altre.

  • L’elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni.
  • I campioni di DNA sono caricati nei pozzetti (fessure) a un’estremità di un gel e viene applicata una corrente elettrica per farli passare attraverso il gel.
  • I frammenti sono caricati negativamente, quindi si muovono verso l’elettrodo positivo. Poiché tutti i frammenti di DNA hanno la stessa quantità di carica per massa, i frammenti più piccoli passano attraverso il gel più velocemente di quelli più grandi.
  • Quando un gel viene colorato con un pigmento che si lega al DNA, i frammenti di DNA possono essere visti come bande, che rappresentano un gruppo di frammenti di DNA della stessa dimensione.

Diversi tipi di elettroforesi su gel delle proteine

Diversi tipi di elettroforesi su gel per le proteine possono essere scelti a seconda dei criteri con cui le proteine devono essere separate. Alcuni metodi elettroforetici comunemente usati sono: SDS-PAGE, native-PAGE e focalizzazione isoelettrica.

SDS-PAGE:

Questo è un metodo denaturante, poiché tratta le proteine con un detergente anionico SDS (sodio dodilsolfato). La struttura secondaria e terziaria viene distrutta da questo processo. Inoltre, l’SDS si lega alle proteine e copre così le loro cariche chimiche, il che rende le proteine ugualmente cariche negativamente.

Pertanto, la seguente separazione avviene solo in base alla dimensione delle catene polipeptidiche nel gel di poliacrilammide.

Native PAGE:

Con questo metodo, le proteine native, non piegate e non denaturate possono essere separate. Questo metodo permette la separazione di proteine che sono inaccessibili con altri metodi. Un esempio potrebbe essere la separazione di proteine modificate e non modificate dello stesso tipo (es. stato fosforilato contro non fosforilato di una proteina). La PAGINA Nativa può anche essere usata per confermare le conformazioni biologicamente rilevanti, come le forme di-, tri- o tetrameriche delle proteine (al contrario della SDS-PAGE, che separerebbe le singole catene peptidiche denaturate). Questo metodo può anche rilevare diversi complessi di diverse proteine.

La separazione tramite “Native PAGE” dipende da una serie di parametri come la carica, la dimensione e la struttura 3D della proteina. Un buffer adatto è necessario per mantenere il ripiegamento 3D della proteina. L’applicabilità del buffer dipende dal punto isoelettrico e carichi di proteine.

Focalizzazione isoelettrica:

Questo metodo si basa sul fatto che una proteina ha una carica specifica a certi valori di pH. A seconda del pH, i gruppi funzionali acidi e basici contribuiscono ad aumentare o diminuire la carica totale della proteina. Il punto isoelettrico è definito come il punto in cui la carica totale della molecola è zero, perché c’è una quantità uguale di cariche negative e positive sulla molecola.

Per la focalizzazione isoelettrica sono necessari speciali gel a gradiente, poiché il pH cambia da acido a basico lungo un gradiente all’interno del gel. A causa di una carica elettrica attaccata al gel, la proteina si sposta nel punto del gel in cui la carica del gel è uguale a quella della proteina, e la carica totale è uguale a zero, cioè il punto isoelettrico. Pertanto, questo metodo viene utilizzato per separare le proteine in base alle loro cariche, nonché per determinare il punto isoelettrico di una proteina target. La separazione avviene in base alla carica della proteina o al numero di gruppi basici e acidi contenuti nella proteina.

I suddetti metodi per l’elettroforesi su gel di proteine possono anche essere combinati per separare le proteine. La scelta dei metodi dipende dai requisiti specifici dell’esperimento.

Blotting

Dopo la separazione della miscela proteica, le bande polipeptidiche vengono trasferite su un supporto a membrana. A questo scopo, la membrana viene fatta aderire al gel e questo cosiddetto sandwich viene trasferito in una camera di elettroforesi. È possibile che una parte dell’SDS venga rimossa e che la proteina venga parzialmente risaturata, cioè che riacquisti la sua struttura 2D e 3D. Tuttavia, la carica elettrica applicata fa sì che le proteine escano dal gel verticalmente nella direzione in cui si sono mosse nel gel, sulla membrana. In questo modo, le bande proteiche si legano alla membrana. Le bande “cancellate” sono ora disponibili per ulteriori elaborazioni (ad esempio per il rilevamento di proteine specifiche con anticorpi specifici).

Immunodetection

L’identificazione degli anticorpi specifici è possibile dopo la separazione e il blotting delle proteine. Gli anticorpi specifici (monoclonali o policlonali) si legano alla “loro” banda proteica. Gli anticorpi non specifici vengono rimossi mediante lavaggio con tamponi contenenti detergenti. Inoltre, le tasche di legame non specifico possono essere bloccate prima dell’aggiunta di anticorpi specifici.

Di solito si applicano prima gli anticorpi primari, che vengono poi riconosciuti da un anticorpo secondario. L’anticorpo secondario è coniugato con colore, radioattività o un enzima per la rilevazione. Anche gli anticorpi coniugati con biotina sono utilizzati a questo scopo.

Perché il Western Blot (Immunoblot) è importante?

Il metodo western blot (immunoblott) ha diversi vantaggi rispetto ad altri saggi immuno-sorbenti (ISA), come l’ELISA.

Il Western blot (immunoblotting) estende l’idea dell’ELISA permettendo la separazione della miscela di proteine per dimensione, carica e/o conformazione. Il metodo di stripping descritto permette il rilevamento di diversi bersagli, in contrasto con l’ELISA, dove solo una proteina può essere rilevata.

Poiché l’elettroforesi del gel proteico separa le proteine in bande, è possibile determinare la dimensione della proteina/peptide target. È anche possibile (semi-)quantificare la proteina di interesse eseguendo una quantità standard interna in parallelo con i campioni sul gel.

Il contenuto proteico dei campioni può anche essere confrontato (“il campione A contiene più proteine del campione B”).

Uno svantaggio del western blot (immunoblot) è che richiede molto tempo (rispetto all’ELISA) e ha un’alta richiesta in termini di competenza dello sperimentatore.

Inoltre, richiede l’ottimizzazione delle condizioni sperimentali (cioè isolamento delle proteine, tamponi, tipo di separazione, concentrazione del gel, ecc.)

Ci sono molti tipi e metodi diversi di western blotting (immunoblotting). Pertanto, copre argomenti e applicazioni molto diversi.

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