La tecnica del Northern blotting è una tecnica utilizzata per studiare l’espressione genica. Viene eseguita tramite il rilevamento di un RNA specifico (o mRNA isolato). L’mRNA è solitamente rappresentato nel 5% della sequenza totale di RNA. Questo metodo rivela l’identità, il numero, l’attività e la dimensione del gene particolare.

Questa tecnica di blotting può essere utilizzata anche per la crescita di un tessuto o di un organismo. Nelle diverse fasi di differenziazione e morfogenesi, l’abbondanza di un RNA cambia, il che può essere identificato da questa tecnica. Può anche identificare stati anormali, malati o infetti a livello molecolare. La tecnica del northern blot è stata sviluppata nel 1977 da James Alwine, David Kemp e George Stank alla Stanford University. La tecnica è stata chiamata così per la somiglianza del processo con il southern blot. La differenza principale tra le due tecniche è che nel nord solo l’RNA è coinvolto nella colorazione.

I sottotipi di blotting, come il nord, l’ovest e il sud, dipendono dalla molecola bersaglio da ricercare. Quando una sequenza di DNA è la base o il codice di una molecola proteica, la particolare molecola di DNA di interesse può essere contrassegnata dal Southern Blotting. Nell’espressione genica, quando il DNA è espresso come mRNA per la produzione di una proteina, questo processo può essere identificato dal Northern blotting. Infine, quando l’mRNA codificato produce la proteina di interesse, questa identificazione della proteina può essere fatta tramite Western blotting.

Procedura generale di essiccazione

• Omogeneizzare il campione.
• Separazione della molecola di interesse utilizzando una membrana per elettroforesi.
• Trasferimento delle molecole su una membrana di nitrocellulosa/nylon.
• Ibridazione o identificazione della molecola.

La tecnica del Northern blotting è una tecnica analitica usata in biologia e in chimica per rilevare RNA specifico da una miscela di RNA. La tecnica è stata sviluppata da James Alwine nel 1971 alla Stanford University.

In questa tecnica :

• Gli RNA sono denaturati rompendo i legami H attraverso l’applicazione di formaldeide (non attraverso l’applicazione di un’endonucleasi di restrizione, come viene fatto nel Southern blotting).
• Gli RNA sono poi immobilizzati su una membrana di nylon o nitrocellulosa dopo la separazione per elettroforesi.
• La rilevazione è fatta da sonde marcate radioattivamente, per esempio P-32, sotto un autoradiogramma o sonde non radioattive (bioluminescenti o legate a un enzima).

La tecnica del Southern blotting consiste in quattro passi fondamentali:

Nella prima fase, il campione di DNA viene diviso o digerito in piccoli pezzi usando un enzima di restrizione. Dopo la digestione, i frammenti di DNA vengono separati mediante elettroforesi su gel. Un gel di agarosio è normalmente usato per questo scopo. L’elettroforesi mostra diverse bande che assomigliano a un blot a causa della presenza di diversi piccoli frammenti di restrizione nel gel. NaOH viene quindi utilizzato per denaturare il DNA in singoli filamenti.

Queste bande vengono poi trasferite sulla superficie di una membrana usando un gradiente elettrico che di solito è un foglio di carta chiamato carta assorbente. Lo schema dei frammenti di DNA sul gel rimane lo stesso dopo il trasferimento sulla carta assorbente.

Una sonda composta da frammenti di DNA a singolo filamento viene quindi introdotta nella carta assorbente. Le basi del DNA sonda saranno accoppiate con sequenze di DNA complementari nel gel per formare il DNA a doppio filamento. La sonda è di solito etichettata con un’etichetta chimica o radioattiva per permettere il tracciamento della sonda nel gel. I substrati chimici e le pellicole a raggi X sono usati per localizzare la sonda se l’etichetta è un enzima. Le etichette radioattive possono apparire direttamente sulle pellicole a raggi X.

Come tutte le normali tecniche di blotting, il Northern blotting inizia con l’elettroforesi per separare i campioni di RNA in base alle dimensioni. L’elettroforesi separa le molecole di RNA in base alla carica degli acidi nucleici. La carica degli acidi nucleici è proporzionale alla dimensione della sequenza dell’acido nucleico.

Quindi, la membrana dell’elettroforesi separa la sequenza di acido nucleico in base alla dimensione della sequenza di RNA. Nei casi in cui la nostra sequenza bersaglio è un mRNA, il campione può essere isolato mediante tecniche di cromatografia con oligocellulosa, poiché gli mRNA sono caratterizzati dalla coda poly(A). Poiché le molecole di gel sono fragili in natura, le sequenze separate vengono trasferite su membrane di nylon. La scelta della membrana di nylon è dovuta al fatto che gli acidi nucleici sono caricati negativamente per natura. Una volta trasferite, le molecole di RNA sono immobilizzate da un legame covalente. La sonda viene poi aggiunta, la sonda può essere complementare a una sequenza ssDNA. La formamide è generalmente usata come tampone di blotting in quanto riduce la temperatura di annealing.

Tecniche come la PCR in tempo reale permettono un rilevamento molto affidabile e rapido anche di una piccola sequenza di bersagli, mentre il Southern blotting richiede una grande quantità di DNA bersaglio. Inoltre, tecniche più recenti come l’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) permettono un’identificazione molto sensibile di specifiche sequenze nucleotidiche in un campione di tessuto con una localizzazione precisa. La PCR in tempo reale e la FISH permettono anche un’accurata quantificazione del bersaglio, che non può essere completamente raggiunta dal Southern blotting.

Il Southern blot ha diverse applicazioni nel laboratorio di biologia molecolare di oggi. Alcune delle principali applicazioni del Southern blot sono

• Identificazione di un singolo gene in un insieme di frammenti di DNA
• Mappatura genetica
• Analisi dei modelli genetici del DNA
• Rilevamento di specifiche sequenze di DNA in un genoma
• lo studio delle delezioni, duplicazioni e mutazioni genetiche che causano varie malattie
• rilevare malattie genetiche e tumori, come la leucemia monoclonale e le mutazioni delle cellule falciformi
• rilevare la presenza di una famiglia di geni in un genoma
• impronte digitali genetiche e test forensi, come il test di paternità e la determinazione del sesso.

La tecnica del Western blot determina il peso molecolare delle proteine e misura l’abbondanza delle proteine in diversi campioni.

Caratteristiche Western Blot :

• Dopo la separazione tramite elettroforesi su gel con il metodo SDS-PAGE, le proteine vengono trasferite su una carta speciale chiamata nitrocellulosa, anche se si possono usare altri tipi di carta o membrane. Le proteine mantengono lo stesso schema di separazione che avevano sul gel.
• Il blot viene incubato con una proteina generica (come una proteina del latte) per legarsi ad eventuali punti appiccicosi rimasti sulla nitrocellulosa. Un anticorpo capace di legarsi alla sua proteina specifica viene poi aggiunto alla soluzione. L’anticorpo è coniugato alla fosfatasi alcalina o alla perossidasi di rafano.
• La posizione dell’anticorpo è rivelata dall’incubazione di un substrato incolore che l’enzima legato converte in un prodotto colorato che può essere visto e fotografato.

Il Western blot (a volte chiamato immunoblot proteico) è una tecnica analitica ampiamente riconosciuta utilizzata per rilevare proteine specifiche in un dato campione omogeneizzato o estratto di tessuto. I campioni di Western blot possono essere prelevati da tessuti interi o da colture cellulari. I tessuti solidi vengono prima macinati meccanicamente usando un frullatore (per grandi volumi di campione), un omogeneizzatore (per piccoli volumi) o tramite sonicazione. Detergenti, sali e vari tamponi possono essere usati per stimolare la lisi cellulare e solubilizzare le proteine.

Questa tecnica usa elettroforesi su gel per separare le proteine native secondo la loro struttura tridimensionale o proteine denaturate secondo la lunghezza del polipeptide.

Protocolo de Western Blot

Il Western blotting (WB) è una tecnica comunemente usata in biologia molecolare e cellulare e nell’ingegneria proteica. Usando un test WB, i ricercatori possono separare e identificare proteine specifiche da una miscela complessa di estrazioni di proteine nelle cellule. Ci sono tre parti principali per questo compito: la separazione in base alla dimensione molecolare, il trasferimento su un supporto solido tramite elettroforesi del gel e l’incubazione della proteina bersaglio con etichette di anticorpi primari e secondari appropriati per la visualizzazione.

FASI DEL FLUSSO DI LAVORO DEL WESTERN BLOTTING:

1. Preparazione del campione: lisi cellulare ed estrazione delle proteine
   Elettroforesi su gel SDS-PAGE
2. Trasferimento della membrana
   a) Trasferimento dalla vasca
   b) Trasferimento semisecco
3. Immunodetection
   a) Protezione immunologica tradizionale
   b) Protocollo di immunodosaggio di 30 minuti con SNAP i.d.
   c) Immunodetection dell’andatura con Immobilon GO

Molte tecniche di dosaggio degli anticorpi, come l’immunofluorescenza indiretta (IIF) e l’enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sono state sviluppate e riviste in passato. Anche se sensibili, questi metodi sono anche soggetti a reazioni incrociate che rendono i risultati positivi deboli difficili da interpretare.

La differenza principale tra la colorazione sud-nord e quella ovest è che la colorazione sud comporta l’identificazione del DNA, quella nord comporta l’identificazione dell’RNA, mentre quella ovest comporta l’identificazione delle proteine.

La colorazione sud, nord e ovest sono tre tecniche di colorazione utilizzate per individuare una specifica molecola di DNA, RNA o proteina in un campione. Durante il blotting, le macromolecole vengono trasferite dal gel a una membrana e si legano a uno specifico acido nucleico o anticorpo che ne facilita la rilevazione.

1. Southernblot
2. Difference Between Southern Northern and Western Blotting
3. PubMed