I metodi di blotting sono considerati come un aiuto all’elettroforesi su gel, che è generalmente applicata per la separazione di DNA/RNA/proteine e produce risultati riproducibili grazie al suo eccellente potere risolutivo.
In questo modo, è possibile rilevare molecole specifiche in mezzo alla combinazione di molecole in fase di separazione. La maggior parte dei metodi ha una fase generale in cui le molecole di interesse, una volta separate, vengono trasferite dal gel a una fase solida della membrana, che si ottiene immergendo una soluzione attraverso il gel e la membrana con carta penetrabile. Molti tipi di dispositivi polivalenti sono anche forniti da molti fornitori per l’elettroblottaggio che è più specificamente utile per il trasferimento iniziato da gel di poliacrilammide meno porosi rispetto ai gel di agarosio porosi comunemente usati. Nel caso del DNA e dell’RNA, la rilevazione di sequenze specifiche sulla membrana viene effettuata tramite ibridazione con sonde marcate con acido nucleico, che nel caso delle proteine viene sostituita dall’uso di sonde marcate con anticorpi.
I protocolli inizialmente sviluppati applicavano sonde radioattive marcate con isotopi radioattivi per la rilevazione mediante l’applicazione di procedure di autoradiografia. In questo processo, il modello di emissione di decadimento radiato di un materiale radioattivo viene utilizzato per produrre un’immagine su pellicola a raggi X che può anche essere disponibile come immagine digitale attraverso l’applicazione di rivelatori di gas basati sulla scintillazione o sistemi basati sulla fosforilazione.
Considerando gli effetti dannosi dell’esposizione alla radioattività, sono stati sviluppati altri tipi di sistemi di etichettatura che includono reagenti fluorescenti e chemiluminescenti. I metodi basati sulla luminescenza/fluorescenza sono considerati sensibili e privi di sfondo, generando così risultati più accurati.
Inoltre, sono state introdotte altre modifiche rispetto al metodo originale, come l’applicazione di sonde di DNA invece di RNA, le membrane di nylon hanno sostituito la tradizionale nitrocellulosa e, per evitare la rinaturazione delle sequenze di DNA durante il trasferimento, il trasferimento viene effettuato in una soluzione alcalina, mentre nel protocollo originale doveva essere effettuato in una soluzione neutra. Il DNA viene trattato con acido per ridurne le dimensioni al fine di aumentare la velocità di trasferimento dei frammenti più grandi.
Le strisce di gel e i gel in provetta applicati nel protocollo originale non vengono più utilizzati, ma vengono invece applicati i formati di gel. Anche se ci sono state molte modifiche al protocollo originale, i protocolli attuali mantengono la maggior parte delle caratteristiche fondamentali del protocollo originale.
Il Southern blotting è stato applicato in molti studi importanti, come la mappatura genetica del genoma umano, che si basava sulla rilevazione dei polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione tramite blotting.
Anche il DNA fingerprinting è stato sviluppato per la prima volta ibridando i prodotti della digestione di restrizione del DNA umano con sonde minisatellite. Tuttavia, la maggior parte delle applicazioni primarie di questo metodo sono state sostituite dal sequenziamento del DNA e dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), poiché forniscono fatti o dati più completi e sono anche facili da applicare.
Tuttavia, il blotting è ancora applicato in molte aree, come la misurazione del numero di copie, l’analisi di lunghi tratti di DNA che sono difficili da amplificare o sequenziare con la PCR o il sequenziamento del DNA, e nel caso dell’analisi strutturale del DNA, dove le forme fisiche del DNA sono separate dall’elettroforesi su gel bidimensionale e successivamente rilevate dal blotting specifico dei componenti.
Omogeneizzazione del campione che comporta la purificazione di DNA/RNA/proteine che viene eseguita dopo l’estrazione da una varietà di fonti come cellule o tessuti.
Digestione del DNA con enzimi di restrizione in frammenti, che non è necessaria per l’RNA (northern blot).
Separazione della molecola di interesse tramite elettroforesi su membrana, di solito su un gel di agarosio per i frammenti di DNA. Nel caso di campioni di RNA, essi possono essere separati su un gel di agarosio in presenza di formaldeide come agente denaturante. Questo è necessario perché la formaldeide confina le strutture secondarie delle molecole di RNA.
Trasferire le molecole (frammenti di DNA/RNA) su una membrana di nitrocellulosa o di nylon dal gel.
Preibridazione (blocco): Lavare la membrana di nylon con una soluzione di pre-ibridazione o di blocco che includa il DNA di sperma di salmone è necessario per bloccare le interazioni non specifiche del DNA e aiuta anche a ridurre il rumore di fondo. In alternativa, ci sono alcuni buffer di bloccaggio disponibili in commercio, come il buffer PerfectHyb™ Plus, dove non è necessario il DNA di salmone per il bloccaggio.
Per la preparazione della sonda viene preparato del DNA fresco marcato con dCTP alfa 32P.
L’ibridazione o l’identificazione della molecola si ottiene incubando il blot con la sonda marcata specifica.
Per il rilevamento della sonda e della sequenza di DNA/RNA di interesse, la pellicola viene esposta a -80°C.
La prima di queste tecniche sviluppate fu il Southern blot, dal nome del Dr. Edwin Southern, che lo sviluppò per identificare specifiche sequenze di DNA. Il Southern blot è una tecnica di rilevamento utilizzata per trovare sequenze di DNA target nel campione di DNA nel campo della biologia molecolare.
Il processo inizia con l’elettroforesi di molecole di DNA che si ibridizzano su una membrana di blotting, seguita da una fase di trasferimento in cui il DNA dal gel viene trasferito sulla membrana di blotting.
La capacità dei filamenti di DNA di ibridarsi deriva dalla loro natura complementare, chiaramente rappresentata nel modello Watson-Crick della struttura del DNA. Inizialmente, gli esperimenti sono stati condotti per studiare la capacità di rinaturazione del DNA e la formazione di ibridi DNA/RNA per capire l’espressione specifica di un tessuto o di una cellula.
Più tardi, l’ibridazione entrò in scena con lo sviluppo di sonde in grado di rilevare sequenze specifiche all’interno del bersaglio e l’immobilizzazione di sequenze bersaglio su un supporto solido come la polvere di nitrocellulosa, che più tardi diede origine alle membrane di nitrocellulosa.
La dimostrazione di Southern che i frammenti di DNA separati dall’elettroforesi su gel possono essere trasferiti su una membrana ha permesso la caratterizzazione del DNA per pattern di ibridazione e dimensioni molecolari. Più tardi, questo metodo è stato applicato per l’identificazione spaziale dei bersagli e il blotting delle colonie batteriche.
La fase di elettroforesi può essere eseguita utilizzando due diversi tipi di gel, come il gel di poliacrilammide (PAGE) con urea e il gel di sodio dodecilsolfato (SDS) con urea. Questi due gel hanno un’applicazione diversa. Quando si usa un gel PAGE, la stessa quantità di frammenti di DNA viene trasferita sulla carta assorbente. Se si usa l’SDS, la risoluzione della banda formata rimane la stessa.
Con questa tecnica, si possono identificare molecole di DNA di dimensioni pari a 100 pg. La tecnica può essere riassunta come la formazione di DNA a doppio filamento che ha un filamento del DNA bersaglio e l’altro del DNA sonda. Il DNA sonda viene prodotto in vitro per la sequenza di interesse.
L’endonucleasi di restrizione, che è un enzima, è usata per rompere il DNA in piccoli frammenti. Questi frammenti sono poi separati per elettroforesi. I frammenti risultanti vengono poi ordinati in base alla loro dimensione (kDa). I frammenti di DNA vengono poi trasferiti su carta per blot dove vengono incubati con le sonde.
Le sonde usate nel Southern blotting possono essere altamente selettive. Possono legarsi selettivamente con una risoluzione di 1 su un milione e hanno le caratteristiche per legarsi ai frammenti target previsti.
Successivamente discuteremo i passi del Southern blot che devi seguire per rilevare una specifica sequenza di DNA in un campione di sangue o di tessuto.
Il DNA può essere estratto da quasi tutti i tessuti umani. Le possibili fonti di DNA su una scena del crimine includono sangue, sperma, tessuti di una vittima morta, cellule del follicolo pilifero e saliva. Il DNA estratto dalle prove del crimine (“traccia” o “traccia” biologica) viene confrontato con il DNA estratto da campioni di riferimento, ottenuti da persone note, di solito sangue.
Il DNA estratto dal campione viene trattato con un’endonucleasi di restrizione, che è un enzima che taglia il DNA a doppio filamento dove ha una sequenza caratteristica. L’enzima più frequentemente usato per l’analisi legale è HaeIII, che taglia il DNA in corrispondenza della sequenza 5′-GGCC-3′.
Dopo la digestione del DNA, i frammenti di DNA risultanti vengono separati in base alle loro dimensioni mediante elettroforesi su gel di agarosio. Durante l’elettroforesi, le molecole di DNA caricate negativamente migrano verso l’elettrodo positivo.
Mentre le molecole di DNA avanzano, la loro velocità di migrazione viene ridotta dalla matrice del gel di agarosio. Le molecole più piccole si muovono più velocemente attraverso i pori del gel rispetto alle molecole più grandi.
Di conseguenza, c’è una continua separazione dei frammenti di DNA in base alle loro dimensioni, con i frammenti più piccoli che si muovono alla massima distanza dall’origine o dal punto di applicazione del campione.
Dopo l’elettroforesi, le molecole di DNA separate vengono denaturate mentre rimangono sul gel di agarosio, impregnandolo di una soluzione alcalina. Dopo la neutralizzazione della soluzione alcalina, il DNA a singolo filamento risultante viene trasferito sulla superficie di una membrana di nylon, facendo una copia o “blot”.
Questo processo di denaturazione e trasferimento è noto come metodo Southern in memoria del suo inventore, Edward Southern. Proprio come l’applicazione di un blotter su una carta bagnata d’inchiostro trasferisce una replica dell’immagine dalla carta al blotter, “tracciare” il DNA nel gel alla membrana di nylon conserva la distribuzione spaziale dei frammenti di DNA raggiunta nel gel come risultato dell’elettroforesi.
Una sonda a singolo locus è una piccola molecola di DNA o RNA in grado di ibridarsi (cioè di formare un duplex DNA-DNA o DNA-RNA) al DNA di un particolare frammento di restrizione nel saggio Southern blot.
La formazione della molecola dicatenaria (duplex) dipende dall’accoppiamento di basi complementari tra le sequenze della sonda e il DNA presente nel “colorante”. Le sonde a singolo locus sono di solito etichettate con un isotopo radioattivo per facilitare il rilevamento, e sono scelte per rilevare un locus genetico polimorfico su un singolo cromosoma umano.
Il Southern blot risultante dalla fase 4 viene incubato in una soluzione contenente una sonda radioattiva per singolo locus in condizioni di temperatura e concentrazione di sale che favoriscono l’ibridazione. Dopo l’ibridazione, la sonda non legata in eccesso viene lavata via in modo che l’unica radioattività rimasta sulla membrana di nylon sia quella associata al DNA del locus bersaglio.
Le posizioni di ibridazione della sonda radioattiva sulla membrana del Southern blot sono rilevate mediante autoradiografia. In questa tecnica, la membrana di nylon viene posta, dopo il lavaggio, accanto a una pellicola a raggi X all’interno di una scatola che la isola dalla luce. La pellicola registra le posizioni in cui avviene il decadimento radioattivo. Dopo l’esposizione e lo sviluppo fotografico, la registrazione risultante dell’ibridazione meridionale è nota come autoradiografia.
In un’analisi legale del DNA, i polimorfismi del DNA su diversi cromosomi sono spesso caratterizzati. Dopo lo sviluppo di un’autoradiografia per la prima sonda, la radioattività può essere lavata via con una soluzione ad alta temperatura, che lascia il DNA in posizione, e ibridata con una seconda sonda radioattiva che si lega a un locus diverso. Le fasi 5-7 vengono ripetute, ogni volta rilevando un locus diverso. Il gruppo di autoradiografie dello stesso Southern blot è noto come ‘profilo del DNA'”.
