Reazione a catena della polimerasi ASO PCR

Reazione a catena della polimerasi (ASO-PCR)

ASO-PCR (metodo alternativo per la rilevazione delle mutazioni)

Introduzione

La reazione a catena della polimerasi allele-specifica dell’oligonucleotide (ASO-PCR) è un metodo alternativo per il rilevamento delle mutazioni.

Il vantaggio di ASO-PCR è che è un metodo veloce, semplice e non radioattivo.

Sempre più spesso vengono scoperte molte sostituzioni di singole coppie di basi che portano a malattie ereditarie, predisposizione a disturbi genetici e cancro.

La capacità di amplificare specifiche sequenze di DNA tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR) ha reso possibile una diagnosi rapida e accurata di molte malattie ereditarie.

Prima dell’uso della PCR, le mutazioni puntiformi sono state identificate usando il clonaggio e il sequenziamento diretto.

Anche il Southern blotting e l’ibridazione con sonde oligonucleotidiche marcate centrate sul sito di mutazione o la digestione con endonucleasi di restrizione.

Questi metodi sono stati notevolmente migliorati dalla PCR, che permette l’amplificazione di frammenti di DNA contenenti siti polimorfici da quantità minime di DNA.

Tuttavia, queste tecniche tendono ad essere lunghe, complesse, richiedono l’uso di un marcatore radioattivo e, nel caso della rilevazione con endonucleasi di restrizione, sono applicabili solo quando la mutazione altera un sito di escissione noto.

Cos'è l'ASO-PCR?

Un oligonucleotide allele-specifico (ASO) è un breve pezzo di materiale di DNA sintetico, complementare alla sequenza di un DNA bersaglio variabile.

Funge da screening per la presenza del target in un saggio Southern blot o, più comunemente, nel più semplice saggio dot blot. È uno strumento comunemente usato in Test genetici, ricerca forense e di biologia molecolare.

Un ASO è tipicamente un oligonucleotide di 15-21 basi nucleotidiche di lunghezza. È progettato (e usato) in un modo che lo rende specifico per una singola versione, o allele, del DNA da testare.

La lunghezza dell’ASO, quale filamento viene scelto e le condizioni con cui viene legato al (e lavato dal) DNA bersaglio giocano tutti un ruolo nella sua specificità.

Queste sonde possono generalmente essere progettate per rilevare una differenza di appena 1 base nella sequenza del gene bersaglio, una capacità fondamentale nel test del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), importante nella genotipizzazione e nelle analisi del Progetto Genoma Umano.

Per essere rilevato dopo che si è legato al suo obiettivo, l’ASO deve essere etichettato con un tag radioattivo, enzimatico o fluorescente.

La tecnologia ASO sfrutta per rilevare una differenza di coppia di basi (citosina contro timina) per misurare la metilazione in un sito CpG specifico.

Cosa significa ASO-PCR?

La reazione a catena della polimerasi allele-specifica dell’oligonucleotide (ASO PCR) è un metodo alternativo per il rilevamento delle mutazioni in cui solo l’oligonucleotide perfettamente abbinato può agire come primer per l’amplificazione. Il vantaggio dell’ASO-PCR è che è un metodo veloce, semplice e non radioattivo.

ASO-PCR, noto anche come sistema di mutazione refrattario all’amplificazione (ARMS), è stato descritto per la prima volta per il rilevamento di mutazioni nel gene dell’α1-antitripsina.

Da allora è stato adottato nello studio di diversi geni, tra cui la diagnosi prenatale della fibrosi cistica, i polimorfismi dell’apolipoproteina E e le mutazioni puntiformi nell’oncogene ras.

In questa tecnica, i primer oligonucleotidici sono progettati per essere complementari alla sequenza normale (wild-type) o mutante, ed entrambi sono utilizzati insieme ad un primer comune.

Poiché la DNA polimerasi manca dell’attività esonucleasica 3′, non è in grado di riparare un mismatch di una singola base tra primer e template all’estremità 3′ dei primer del DNA.

Pertanto, se i primer oligonucleotidici sono progettati per contenere mismatch vicino o all’estremità 3′, il primer si estenderà o meno a seconda di quali polimorfismi alternativi a base singola sono presenti nella sequenza target.

Pertanto, in condizioni rigorose appropriate, solo il DNA bersaglio esattamente complementare al primer sarà amplificato.

Un semplice protocollo per la PCR nucleotidica allele-specifica è mostrato di seguito.

Come funziona?

La reazione a catena della polimerasi allele-specifica (ASPCR) è un’applicazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) che permette il rilevamento diretto di qualsiasi mutazione puntiforme nel DNA umano attraverso l’analisi dei prodotti della PCR su un gel di agarosio o poliacrilammide colorato con bromuro di etidio.

Pionero

È stato il pioniere dell’uso di oligonucleotidi sintetici come sonde specifiche per le variazioni di sequenza. genetics da R. Bruce Wallace, che lavorava al City of National Hope Medical Center di Duarte, California.

Nel 1979, Wallace e i suoi collaboratori riportarono l’uso di sonde ASO per rilevare variazioni in un virus batterico a singolo filamento, e successivamente applicarono la tecnica per clonare geni umani.

Nel 1983 e nel 1985 il laboratorio di Wallace ha riportato il rilevamento di mutazioni per l’anemia falciforme in campioni di “DNA genomico intero”, anche se questa applicazione era ostacolata dal piccolo numero di tag che potevano essere trasportati da ASO.

Fortunatamente la PCR, un metodo per amplificare notevolmente un segmento specifico di DNA, è stata riportata nel 1985.

In meno di un anno la PCR era stata abbinata all’analisi ASO. Questa combinazione risolse il problema dell’etichettatura ASO, poiché la quantità di DNA bersaglio poteva essere ampliata rispetto a quella preesistente.

Inoltre, la specificità del processo PCR stesso poteva essere aggiunta a quella delle sonde ASO, riducendo il problema del legame spurio dell’ASO a sequenze non bersaglio.

La combinazione era abbastanza specifica da poter essere usata in un semplice dot blot, evitando il laborioso e inefficiente metodo southern white/black blot.

PCR basata sul test dell'oligonucleotide allele specifico (ASO)

Nuovo sequenziamento del DNA di una serie di pesci identifica: un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) corrispondente a due alleli (A e B) di un singolo gene (in alto, al centro).

Vengono costruiti due primer PCR specifici per gli alleli SNP A e B, rispettivamente.

Questi oligonucleotidi allele-specifici (ASO) sono accoppiati con un primer di ancoraggio per una sequenza di DNA comune a tutti i pesci (sopra, a destra).

Il progresso della PCR è monitorato in “tempo reale” e una reazione riuscita indica la presenza dell’allele SNP corrispondente.

aso-pcr

Applicazione all'acquacoltura

Un allevatore di pesci vuole sapere se alcuni dei pesci (maschi) usati in un esperimento di riproduzione di massa contribuiscono in modo sproporzionato al pool genetico della generazione successiva.

Seleziona due maschi che sono omozigoti per lo SNP A e B, rispettivamente, e una femmina non marcata (sopra, a sinistra).

I tre pesci possono deporre le uova a caso; vengono selezionate 48 larve (in basso a sinistra).

Test ASO A e B vengono eseguiti contemporaneamente su tutte le larve in un formato piastra a 96 pozzetti, in file alternate (in basso a destra).

Qui, solo 8 delle 48 larve hanno l’allele B, indicando un vantaggio riproduttivo di cinque volte del genitore A.

Applicazione della biodiversità

Un manager della pesca vuole conoscere l’abbondanza rilevante delle uova di pesce di due specie diverse di dimensioni simili trovate nel plancton.

Identifica una regione in cui le due specie differiscono per un singolo SNP, producendo alleli A e B, rispettivamente (sopra, a sinistra).

Vengono costruiti gli ASO specifici per A e B (in alto a destra).

Il DNA viene estratto da ciascuna delle 48 uova (in basso a sinistra), e la A e B ASOs vengono eseguiti su ogni uovo contemporaneamente in un formato di piastra a 96 pozzetti, in file alternate (in basso a destra).

Qui, solo 8 delle 48 larve hanno l’allele B, indicando una abbondanza di cinque volte della specie A rispetto alla specie B.

Questo metodo “RT-PCR ASO” è un’alternativa al tradizionale requisito dei saggi elettroforetici e permette uno screening rapido e su larga scala di popolazioni e coorti larvali.

References

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