isolamento del DNA

Protocollo di isolamento del DNA plasmidico, principio, passi…

L’isolamento del DNA plasmidico o “isolamento del DNA plasmidico” dal microorganismo è un approccio critico nella biologia molecolare ed è un passo cruciale in molti processi che includono la clonazione, il sequenziamento del DNA, la trasfezione e la terapia genica. Questi processi richiedono l’isolamento del DNA plasmidico ad alta purezza.
Il DNA plasmidico purificato può essere utilizzato immediatamente in tutte le procedure di biologia molecolare come la digestione con enzimi di restrizione, il clonaggio, la PCR, la trasfezione, la traduzione in vitro, il blotting e il sequenziamento.

Fasi per l’estrazione del DNA plasmidico

  • Coltivazione dei campioni batterici

In primo luogo, le cellule batteriche devono essere coltivate in quantità variabili di terreno di crescita. Normalmente, un antibiotico viene aggiunto al mezzo di crescita, e il DNA plasmidico trasmetterà la resistenza agli antibiotici ai batteri. È possibile rimuovere le cellule dal mezzo di crescita e scartare il surnatante per centrifugazione. Al termine di questa fase, le cellule diventano pellet mobili.

  • Risospendere le cellule in pellet nella soluzione tampone.

Successivamente, risospendere le cellule in una soluzione isotonica contenente Tris, EDTA (per destabilizzare la parete cellulare e prevenire danni al plasmide), glucosio (per evitare che le cellule scoppino) e RNasi A (per degradare l’RNA cellulare durante la lisi cellulare).

  • Lisi delle cellule

Successivamente, viene aggiunta una soluzione alcalina contenente idrossido di sodio e sodio dodecil solfato (SDS) per facilitare la lisi cellulare e la denaturazione del DNA genomico e plasmidico insieme a tutte le proteine presenti nella soluzione. La soluzione altamente alcalina composta da NaOH e SDS rompe le membrane cellulari e converte il DNA a doppio filamento (dsDNA) in DNA a filamento singolo (ssDNA).

  • Neutralizzare la soluzione con acetato di potassio

Una soluzione di acetato di potassio neutralizza il campione e separa il DNA plasmidico dal DNA genomico (gDNA). Il DNA plasmidico più piccolo si rinatura facilmente, mentre il DNA genomico più grande e complicato precipita fuori dalla soluzione.

Dopo la centrifugazione, il DNA genomico e le proteine precipitate formano un pellet, mentre il DNA plasmidico rimane solubile. L’ultimo DNA plasmidico all’interno del surnatante può essere portato su con etanolo o purificato l’uso di spin-clear fuori era o una miscela fenolo-cloroformio.

  • Precipitare il DNA plasmidico con precipitazione in etanolo.

Infine, devi isolare il DNA plasmidico con un processo noto come precipitazione con etanolo. Una volta precipitato, dovresti sciacquare il precipitato (il DNA plasmidico) in etanolo freddo al 70% e lasciarlo asciugare per circa 10 minuti per far evaporare l’alcol. Dovresti anche risospendere il pellet di DNA in una soluzione tampone contenente Tris, EDTA e RNasi per pulire qualsiasi RNA rimanente nella soluzione.

Suggerimenti da tenere a mente per l’isolamento dei plasmidi

L’isolamento dei plasmidi può essere impegnativo, quindi tieni a mente i seguenti suggerimenti quando estrai il DNA plasmidico:

Eseguire la lisi cellulare rapidamente per evitare la denaturazione irreversibile del plasmide.
I tamponi di risospensione e di lisi devono essere mescolati bene, quindi assicurati di non combinarli vigorosamente per evitare di rompere il DNA in frammenti più piccoli. Se sono abbastanza piccoli, il gDNA rotto può ricongiungersi e rimanere in soluzione.
Indossare guanti e un’adeguata protezione per gli occhi mentre si opera con composti chimici aggressivi insieme a NaOH e SDS.

 

Principio

La purificazione del DNA plasmidico dal DNA batterico si basa sulla denaturazione differenziale del DNA cromosomico e plasmidico mediante lisi alcalina per separare i due. Le fasi principali dell’isolamento del plasmide sono la rottura della forma mobile per creare un lisato, la separazione del plasmide dal DNA cromosomico, dalle particelle mobili e da altro materiale insolubile. I batteri vengono lisati o trattati con un tampone di lisi contenente sodio dodecil solfato (SDS) e idrossido di sodio.

Durante questa fase, la maggior parte delle cellule viene disgregata, il DNA cromosomico e plasmidico viene denaturato e il lisato risultante viene ripulito tramite centrifugazione, filtrazione o strippaggio magnetico. La successiva neutralizzazione con acetato di potassio permette alla maggior parte del DNA plasmidico covalentemente bloccato di riunirsi e continuare ad essere solubilizzato. La maggior parte del DNA cromosomico e delle proteine precipita in un complicato sistema con potassio e SDS, che viene eliminato attraverso la centrifugazione.

Quale soluzione si usa nell’isolamento del DNA?

Questa soluzione contiene idrossido di sodio e SDS (sodio dodecil solfato). L’idrossido di sodio denatura il DNA plasmidico e cromosomico in singoli filamenti.