L’antigene embrionale specifico della fase 3 (SSEA-3)

L'antigene embrionale specifico della fase 3 (SSEA-3)

L’antigene embrionale specifico della fase 3 (SSEA-3) è un glicosingolipide, in particolare, un oligosaccaride composto da cinque unità di carboidrati collegati a uno sfingolipide. Gli sfingolipidi sono stati originariamente scoperti nel 1884 da Johann Ludwig Wilhelm Thudichum che li chiamò come la Sfinge della mitologia greca in riferimento all’enigma irrisolto della loro funzione. Ora si sa che gli sfingolipidi funzionano come attori chiave nella segnalazione cellulare e la molecola SSEA-3 nel suo insieme gioca un ruolo chiave nell’identificazione di molti tipi di cellule di mammiferi con caratteristiche pluripotenti e simili alle cellule staminali.

La scoperta delle cellule staminali del cancro (CSC), che sono responsabili dell’auto-rinnovamento e della crescita tumorale in tessuti tumorali eterogenei, ha stimolato l’interesse per lo sviluppo di nuove terapie del cancro e la diagnosi precoce. Tuttavia, i marcatori attualmente utilizzati per l’isolamento delle CSC spesso non sono abbastanza selettivi per arricchire le CSC per lo studio di questa speciale popolazione di cellule. Qui dimostriamo che le CSC del seno isolate con i marcatori CD44(+)CD24(-/lo)SSEA-3(+) o ESA(hi)PROCR(hi)SSEA-3(+) avevano una maggiore tumorigenicità di quelle con i marcatori convenzionali in vitro e in vivo. Solo 10 cellule con CD44(+)CD24(-/lo)SSEA-3(+) hanno formato un tumore nei topi, rispetto a più di 100 cellule con CD44(+)CD24(-/lo). La soppressione dell’espressione di SSEA-3 mediante il knockdown del gene che codifica per la β-1,3-galattosiltransferasi 5 (β3GalT5) nel percorso della globo-serie, ha portato all’apoptosi nelle cellule tumorali in modo specifico ma non ha avuto effetto sulle cellule normali. Questa scoperta è ulteriormente supportata dall’analisi di SSEA-3 e dei due epitopi correlati della globo-serie SSEA4 e globo-H in cellule staminali (cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte) e varie cellule normali e tumorali, e dall’approccio anticorpale per colpire i glicani della globo-serie e gli studi clinici in fase avanzata di un vaccino contro il cancro al seno.

La tumorigenicità delle cellule portatrici di

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Fig. 1. La tumorigenicità delle cellule portatrici di marcatori convenzionali e di SSEA-3 era superiore a quella di altre sottopopolazioni. (A e B) Percentuale di formazione di colonie di cellule o mammosfere della sottopopolazione isolata da marker selezionati per la coltura in sospensione o il saggio su soft agar in MCF-7 o MDA-MB-231 rispettivamente. I grafici sono i campioni tripli di un esperimento rappresentativo. (C e D) Il numero di tumori formati nella ghiandola mammaria di NS iniettati con sottopopolazioni cellulari che esprimono marker selezionati da linee cellulari di cancro al seno MDA-MB-231 e MCF-7. Il corrispondente saggio di diluizione limitante è stato fatto in vivo. (E e F) Il volume tumorale da diverse sottopopolazioni di MDA-MB-231 (2500 cellule / iniezione), e MCF-7 (500 cellule per iniezione) è stato monitorato e confrontato (n = 4 tumori per gruppo). #, La percentuale di SSEA-3 + cellule ordinate nella popolazione totale delle cellule. I dati rappresentano la media e la SD. Gli asterischi indicano la significatività statistica, P <0,05.

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Fig. S1. Le sottopopolazioni nelle linee cellulari ottenute tramite smistamento per saggi in vitro e in vivo. Sottopopolazioni tra cui CD44+ CD24hi, CD44+ CD24-/lo, CD44+ CD24-/lo SSEA-3+, CD44+ CD24/lo SSEA-3-, varie percentuali di SSEA-3+ (top 1, 5, 10%), e SSEA-3- in MCF-7 (A), così come ESAloPROCRlo, ESAhiPROCRhi, ESAhiPROCRhiSSEA-3+, ESAhiPROCRhiSSEA-3-, varie percentuali di SSEA-3+ (top 1, 5, 10%), e SSEA-3- in MDA-MB-231 (B), sono stati arricchiti tramite colorazione cellulare (Materiali e Metodi) e citometria a flusso per ulteriori analisi.

Fig. S2. I BCSC non sono stati arricchiti con epitopi della serie globo SSEA-4 e globo-H da saggi in vitro. (A-D)

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Fig. S2. I BCSC non sono stati arricchiti con epitopi della serie globo SSEA-4 e globo-H da saggi in vitro. (A-D) Percentuale di formazione di colonie di cellule non selezionate o di marcatori selezionati (set di marcatori noti CD24/CD44 o ESA/PROCR, insieme a SSEA-4 o globo-H) che esprimono sottopopolazioni di cellule del cancro al seno MCF-7 e MDA-MB-231. I grafici sono i campioni tripli di un esperimento rappresentativo. I dati rappresentano la media e la DS. Gli asterischi indicano la significatività statistica, P <0,05; n.s., non significativo.

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Fig. 2. Knockdown o sovraespressione di β3GalT5 in MCF-7 e MDA-MB-231 cultura cellulare ridotto o aumentato il livello di SSEA-3 sulla superficie cellulare e le proprietà di staminalità da analisi FACS. L’espressione dei marcatori CSC e SSEA-3 nelle cellule parentali. Il livello di SSEA-3 nelle sottopopolazioni CD44+CD24-/lo e ESAhi PROCRhi gated nel gruppo β3GalT5 sovraespresso è stato anche determinato. (A) L’espressione di CD24, CD44, e SSEA-3 in MCF-7 con sovraespressione, abbattuto di β3GalT5 o il loro controllo vettore corrispondente. (B) L’espressione di ESA, PROCR e SSEA-3 in MDA-MB-231 con sovraespressione, abbattuto di β3GalT5 o il loro controllo vettore corrispondente. Tutti gli esperimenti sono il campione rappresentativo da triplicato.

Il percorso di globo-serie nell'uomo.

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Fig. S3. Il percorso di globo-serie nell’uomo. Il percorso biosintetico degli epitopi della serie globo SSEA-3, SSEA-4 e globo-H da Gb4 con le corrispondenti glicotransferasi.

Knockdown di β3GalT5 ha causato una riduzione del tasso di proliferazione e un aumento dell'apoptosi nella cultura delle cellule tumorali

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Fig. 3. Knockdown di β3GalT5 ha causato una riduzione del tasso di proliferazione e un aumento dell’apoptosi nella coltura di cellule tumorali, ma nessun effetto sulla coltura di cellule mammarie normali. (A-D) Il tasso di proliferazione nelle colture di cellule tumorali MCF-7 e MDA-231, così come le colture di cellule mammarie normali MCF-10A e hTERT-HME1. Tasso di proliferazione, in termini di assorbanza (A450nm-A690nm), è il triplicato da un campione rappresentativo. (E) Le cellule MDA-MB-231 infettate con shRNA β3GalT5 o vettore shRNA sono state lisate e sono stati preparati l’estratto cellulare intero, le frazioni citoplasmatiche e nucleari. In alto, analisi Western blot dell’anticorpo anti-caspasi-3; al centro, quello dell’anticorpo della caspasi-3 scissa; in basso, quello della β-actina (servita come controllo di carico). (F e G) La percentuale di cellule apoptotiche MDA-MB-231 con β3GalT5 knockdown. Le cellule MDA-MB-231 sono state trattate con gli inibitori della caspasi-3 Z-DEVD in diverse concentrazioni o gli inibitori della caspasi-8, -9, o -12. I dati qui rappresentati sono la media e la SD di campioni triplicati. Gli asterischi indicano la significatività statistica, P <0,05; n.s., non significativo.

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