gene knockout knockout genico

Knockout genico (gene knockout)

Il knockout genico, chiamato anche inattivazione genica, è una tecnica genetica in cui l’espressione di un particolare gene in un organismo viene soppressa sostituendo il gene originale nel suo locus genetico con una versione modificata del gene in cui uno o più esoni sono stati eliminati, ottenendo organismi che non esprimono il gene in un particolare tessuto o nell’intero organismo. Questi organismi sono anche chiamati knockout.

Un knockout è identico al precedente, ma invece di eliminare un particolare gene, lo sostituisce con una versione alterata del gene che produce una funzione aggiuntiva.

Blocco del gene o knockout del gene

Le tecnologie di blocco dei geni sono utilizzate per alterare i genomi di tutti gli organismi viventi. Quando una mutazione inattiva la funzione di un gene, si parla di knockout genico. I metodi di knockout genico sono usati per identificare la funzione di un particolare gene inibendo la funzione di quel gene.

Questo processo è usato sia nella genetica classica che nelle tecniche moderne come la genomica funzionale. Inizialmente, il knockout genico è stato eseguito tramite mutagenesi del trasposone. Lo svantaggio principale di questo metodo è il tedioso screening per trovare il gene neutralizzato. L’eliminazione di altri organismi è stata ottenuta con l’aiuto dell’ingegneria genetica.

Le tecniche in vitro sono utilizzate per modificare i geni in plasmidi o cromosomi artificiali batterici (BAC), e questi costrutti modificati sono poi trasferiti all’organismo in questione utilizzando tecniche di coltura cellulare. Altri metodi usano una combinazione di ingegneria genetica e ricombinazione omologa in vivo. Tuttavia, questa combinazione non è così efficace.

La ricombinazione omologa è lo strumento definitivo per produrre knockout genici. Permette la dichiarazione diretta del cromosoma batterico o la modifica di qualsiasi plasmide o BAC in vivo come precursori. Questa tecnica non si basa su siti di restrizione. Una cassetta del farmaco può essere collocata ovunque in un gene o la lettura aperta del gene può essere sostituita dalla cassetta del farmaco. In entrambi i casi, viene selezionato il costrutto desiderato.

Metodi di knockout genico (gene knockout)

Sono disponibili diverse tecniche di biologia molecolare per influenzare l’espressione genica. Queste tecniche differiscono per gli strumenti utilizzati, il tempo necessario per ottenere un risultato positivo e la specificità del risultato. Queste tecniche includono:

  • Ricombinazione omologa: il gene originale viene sostituito da una versione mutata. Questa versione mutata può eliminare quasi tutta la sequenza del gene o lasciare l’espressione dei primi esoni. Di solito ci vogliono diversi mesi per ottenere individui modificati (soprattutto nei topi), anche se hanno il vantaggio di essere molto specifici: a questi organismi manca solo il gene target.
  • Transgenesi, che consiste nell’introdurre sequenze nel gene originale che lo modificano per produrre cambiamenti che si traducono in proteine non funzionali. Questa è una tecnica generalmente più veloce, il cui svantaggio è che il gene endogeno è ancora presente e può produrre una proteina, anche mutata, che può influenzare altre molecole nella via metabolica a cui appartiene. Inoltre, una nuova mutazione può verificarsi per caso e invertire la modifica introdotta producendo nuovamente la proteina originale, il che non è raro..
  • Mutagenesi. I mutanti possono essere ottenuti utilizzando un prodotto mutageno (ad esempio EMS) che produce mutazioni casuali. Vengono quindi selezionati gli organismi che portano i codoni “STOP” nella sequenza desiderata. Questo è un metodo rapido per ottenere mutanti, anche se non è specifico per il gene bersaglio, il che può portare a delle battute d’arresto.
  • Demolizione. Le sequenze di DNA che esprimono molecole di RNA interferenti possono essere introdotte nel genoma di un organismo o direttamente nelle cellule. Queste molecole interferiscono specificamente con l’espressione del gene bersaglio, di solito risultando in un’espressione ridotta (per questo motivo sono anche chiamate “knockdown”). Questa tecnica è più veloce che ottenere un organismo knock-out, ma non porta alla completa eliminazione dell’espressione, e la sequenza introdotta che codifica l’RNA interferente può anche subire mutazioni che inattivano l’effetto desiderato.

Tecnologie di knock-out genetico

Il miglior approccio per produrre un gene knockout è la ricombinazione omologa. Con i metodi di knockout genico, un singolo gene viene eliminato senza influenzare tutti gli altri geni di un organismo. Con questo metodo, l’organismo in cui il gene in questione non è più funzionale è chiamato organismo knockout. Quando più di un gene viene eliminato in un organismo, si parla di double knock-out o DKO, triple knock-out o TKO e quadruple knock-out o QKO, a seconda del numero di geni.

Metodi di ingegneria genetica

Il knock-out genico viene effettuato con elementi come plasmidi, costrutti di DNA o cromosomi batterici artificiali.
Il processo di knock-out genico di solito produce animali transgenici in cui il gene target è stato alterato. Per creare animali transgenici, le cellule staminali embrionali o ES vengono modificate geneticamente e nella fase successiva le cellule ES trasformate vengono inserite nei primi embrioni.

Gli animali trasformati prodotti in questo modo hanno la capacità di trasmettere il gene trasformato alle generazioni successive.

Teoria del knockout genico

La ricombinazione è definita come ingegneria genetica mediata dalla ricombinazione omologa in vivo. La ricombinazione viene eseguita con l’aiuto di un batteriofago. I batteriofagi come λ Red, RecET o sistemi simili sono i più usati. La ricombinazione può essere utilizzata anche per delezioni, mutazioni puntiformi, duplicazioni, inversioni, fusioni e tag. Un substrato di DNA lineare contenente la modifica o le omologie desiderate viene introdotto nel DNA bersaglio delle cellule. Le cellule esprimono enzimi ricombinanti codificati dal fago. Questi enzimi aiutano a incorporare il DNA lineare nella molecola bersaglio. In questo modo, si producono molecole ricombinanti. Il sistema di ricombinazione più comunemente usato è quello del batteriofago λ Red. Questo sistema consiste nelle tre proteine Gam, Exo Beta. La proteina Gam inibisce l’esonucleasi RecBCD dell’E. coli, che normalmente degrada il dsDNA lineare. Gam non è essenziale per la ricombinazione, ma aumenta la frequenza di ricombinazione del dsDNA fino a 20 volte. Exo è un’esonucleasi specifica per il DNA a doppio filamento 5’→3′ ed è necessaria per la ricombinazione del dsDNA. La proteina beta, una proteina annexina del DNA, è la ricombinasi centrale per la ricombinazione.

È importante notare che le funzioni di ricombinazione dell’ospite, compresa la proteina di ricombinazione chiave RecA, non sono richieste per la ricombinazione.

Sources

  1. Gene Method
  2. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors
  3. CRISPR