Isolamento di plasmide

Isolamento di plasmide

Introduzione

L’isolamento dei plasmidi consiste in cinque fasi: lisi cellulare, rimozione dei detriti, precipitazione dell’acido nucleico, isolamento dell’acido nucleico e risospensione.

Una preparazione del plasmide è un metodo per estrarre e purificare il DNA plasmidico. Sono stati sviluppati molti metodi per purificare il DNA plasmidico dai batteri.

Questi metodi comportano invariabilmente tre fasi:

  • Crescita della coltura batterica
  • Raccolta e lisi dei batteri
  • Purificazione del DNA plasmidico

Il termine “plasmide” è stato coniato da Joshua Lederberg nel 1952, e l’Isolamento di plasmide si basa su questo termine. I plasmidi sono elementi genetici extracromosomi presenti nella maggior parte delle specie di Archae, Eukarya ed Eubacteria.

I plasmidi sono molecole di DNA circolari a doppio filamento che si distinguono dal DNA cromosomico delle cellule.

La struttura e la funzione di una cellula batterica sono dirette dal materiale genetico contenuto nel DNA cromosomico. In alcuni casi, i plasmidi non sono solitamente essenziali per la sopravvivenza del batterio ospite.

I plasmidi contribuiscono alla diversità genetica e alla plasticità dei batteri. Codificano funzioni che possono non essere specificate dal DNA cromosomico batterico.

I plasmidi specificano i tratti che permettono all’ospite di persistere in ambienti altrimenti letali o che limitano la crescita. Per esempio, la resistenza agli antibiotici e l’espressione delle proteine. I geni di resistenza agli antibiotici sono spesso codificati dal plasmide, permettendo al batterio di persistere in un ambiente contenente antibiotici.

Questo dà ai batteri un vantaggio competitivo rispetto alle specie sensibili agli antibiotici. Inoltre, come strumento, i plasmidi possono essere modificati per esprimere la proteina di interesse (ad esempio, la produzione di insulina umana utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante).

I plasmidi sono serviti come preziosi sistemi modello per lo studio di processi come la replicazione del DNA, la segregazione, la coniugazione e l’evoluzione. I plasmidi sono stati centrali per la moderna tecnologia del DNA ricombinante come strumento per la clonazione genica e come veicolo per l’espressione genica.

lisi cellulare

Caratteristiche del plasmide

I plasmidi presenti nei batteri differiscono nelle loro proprietà fisiche:

  • la dimensione (kbp)
  • la geometria
  • il numero di copie

Dimensione del plasmide

I plasmidi variano in dimensioni da 1 kbp (kilo coppia di basi) a 1000 (kilo coppia di basi) megaplasmidi che hanno molte centinaia di coppie di basi.

Geometria del plasmide

Anche se la maggior parte dei plasmidi ha una geometria circolare, ci sono ora molti esempi di plasmidi che sono lineari in una varietà di batteri.

Il DNA plasmidico può apparire in una delle cinque conformazioni: DNA circolare aperto, che ha un filamento tagliato; DNA circolare rilassato, che è completamente intatto con entrambi i filamenti non tagliati, ma è stato rilassato enzimaticamente; DNA lineare, che ha le estremità libere; DNA superavvolto, che è completamente intatto con entrambi i filamenti non tagliati; e DNA superavvolto denaturato, che è come il DNA superavvolto, ma ha regioni non appaiate che lo rendono leggermente meno compatto.

Numeri di copie del plasmide

Copy number refers to the average or expected number of copies per host cell. Plasmids have a low, medium or high copy number. Knowing which category the plasmid belongs to is very important when starting an experiment.

If you work with a low copy number plasmid that is associated with a low yield and therefore you might need to set up more cultures. On the other hand, if low yield is obtained with a high copy number plasmid, troubleshooting is required.

In bacteria with high copy number plasmids, during cell division plasmids segregate randomly into daughter cells, whereas in low copy number bacteria, during cell division and partitioning plasmids divide equally into daughter cells.

An advantage of high copy number is the increased stability of the plasmid when random partitioning (i.e. partitioning of plasmids into daughter cells) occurs during cell division.

Isolamento di plasmide

L’isolamento del DNA plasmidico dai batteri è una tecnica cruciale in biologia molecolare ed è un passo essenziale in molte procedure come la clonazione, il sequenziamento del DNA, la trasfezione e la terapia genica. Queste manipolazioni richiedono l’isolamento di DNA plasmidico ad alta purezza. Il DNA plasmidico purificato può essere utilizzato immediatamente in tutte le procedure di biologia molecolare come la digestione con enzimi di restrizione, il clonaggio, la PCR, la trasfezione, la traduzione in vitro, il blotting e il sequenziamento.

La lisi alcalina è un metodo usato in biologia molecolare per isolare il DNA plasmidico o altri componenti cellulari, come le proteine, mediante scissione delle cellule. I batteri che contengono il plasmide di interesse vengono prima coltivati e poi lisati con un tampone di lisi alcalina composto da un detergente a base di sodio dodecilsolfato (SDS) e una forte base di idrossido di sodio. Il detergente squama il bilayer fosfolipidico della membrana e gli alcali denaturano le proteine coinvolte nel mantenimento della struttura della membrana cellulare. Attraverso una serie di passaggi che coinvolgono agitazione, precipitazione, centrifugazione e rimozione del surnatante, i detriti cellulari vengono rimossi e il plasmide viene isolato e purificato.

Principio

La purificazione del DNA plasmidico dal DNA batterico si basa sulla denaturazione differenziale del DNA cromosomico e plasmidico mediante lisi alcalina per separare i due.

Le fasi fondamentali dell’Isolamento di plasmide sono la rottura della struttura cellulare per creare un lisato, la separazione del plasmide dal DNA cromosomico, dai detriti cellulari e da altro materiale insolubile. I batteri vengono lisati con un tampone di lisi contenente sodio dodecil solfato (SDS) e idrossido di sodio. Durante questa fase, la maggior parte delle cellule viene distrutta, il DNA cromosomico e plasmidico viene denaturato e il lisato risultante viene pulito mediante centrifugazione, filtrazione o strippaggio magnetico. La successiva neutralizzazione con acetato di potassio permette solo al DNA plasmidico covalentemente bloccato di riunirsi e rimanere solubilizzato. La maggior parte del DNA cromosomico e delle proteine precipita in un complesso formato con potassio e SDS, che viene rimosso per centrifugazione.

I batteri vengono risospesi in un tampone di risospensione (50mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml RNase A, pH 8.0) e poi trattati con 1% SDS (w/v) / tampone di lisi alcalina (200mM NaOH) per rilasciare il DNA plasmidico dalle cellule ospiti E. coli.

Il tampone di neutralizzazione (acetato di potassio 3,0 M, pH 5,0) neutralizza il lisato risultante e crea condizioni adatte al legame del DNA plasmidico alla colonna di membrana di silice. La proteina precipitata, il DNA genomico e i detriti cellulari sono separati da una fase di centrifugazione e il surnatante viene caricato su una colonna.

Contaminazioni come sali, metaboliti e componenti cellulari macromolecolari solubili vengono rimosse con un semplice lavaggio con tampone di lavaggio etanolico (1.0 M NaCl, 50mM MOPS, pH 7.0, isopropanolo (v/v) 15 %).

Il DNA plasmidico puro viene infine eluito in condizioni di bassa forza ionica con un tampone leggermente alcalino (5 mM Tris/HCl, pH 8.5).

I media

La resa e la qualità del DNA plasmidico dipendono fortemente dal tipo di terreno di coltura utilizzato. La maggior parte delle purificazioni di plasmidi sono ottimizzate con colture su terreno standard Luria Bertani (LB).

Per preparare il terreno LB, sciogliere 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di NaCl in 800 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 7,0 con 1 N NaOH. Regolare il volume a 1 litro aggiungendo acqua distillata e autoclavare.

La coltura cellulare dovrebbe essere incubata a 37 °C con agitazione costante (200-250 rpm) preferibilmente per 12-16 ore durante la notte. Generalmente, si può ottenere una OD di 3-6. In alternativa, possono essere utilizzati mezzi ricchi come 2 x YT (lievito/triptone), TB (brodo terrificante) o CircleGrow.

Si dovrebbe anche prestare attenzione, in quanto la crescita eccessiva di una cultura può portare ad una maggiore percentuale di cellule morte o affamate e il DNA plasmidico risultante potrebbe essere parzialmente degradato o contaminato da DNA cromosomico. Per trovare le condizioni di coltura ottimali, il terreno di coltura e i tempi di incubazione devono essere ottimizzati per ogni combinazione di ceppo ospite/costrutto plasmidico individualmente.

Lisazione e neutralizzazione

Le formule di lisi possono variare a seconda che si desideri l’estrazione di DNA/RNA/plasmidi. Tutti i metodi di lisi batterica produrranno soluzioni plasmidiche contaminate da DNA cromosomico e RNA. La centrifugazione rimuove la maggior parte del DNA cromosomico (formerà un pellet, mentre il DNA plasmidico rimane solubile), e il trattamento con RNasi rimuoverà l’RNA contaminante.

In generale, i buffer di lisi contengono un’alta concentrazione di sali caotropici. I caotropi hanno due importanti funzioni nell’estrazione dell’acido nucleico. In primo luogo, destabilizzano i legami idrogeno, le forze di Van der Waals e le interazioni idrofobiche, portando alla destabilizzazione delle proteine, comprese le nucleasi. In secondo luogo, interrompono l’associazione degli acidi nucleici con l’acqua, fornendo così condizioni ottimali per il loro trasferimento sulla silice.

I plasmidi vengono separati e rimossi dalla cellula batterica risospendendo 1-5 mL di coltura in un tampone di risospensione (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml RNase A, pH 8.0) e pellettando le cellule in una microcentrifuga a 11000 x g per 30 s. Le cellule vengono poi lisate aggiungendo 250 µg/ ml di tampone di coltura (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml RNase A, pH 8.0).

La lisazione si ottiene aggiungendo 250 µl di tampone di lisi con tampone di neutralizzazione, in quanto aiuta la completa precipitazione di SDS, proteine e DNA genomico. Una neutralizzazione incompleta porta ad una riduzione della resa. Tuttavia, il DNA plasmidico rilasciato è molto vulnerabile a questo punto e agitando troppo o troppo forte si danneggia il DNA.

Fissaggio e lavaggio sulla membrana di silice

Dopo la centrifugazione del lisato attraverso la membrana di silice, gli acidi nucleici desiderati dovrebbero essere legati alla colonna e le impurità, come proteine e polisaccaridi, dovrebbero essere nel flusso.

Nel caso di campioni vegetali, è probabile che contengano polisaccaridi e pigmenti, mentre nel caso di campioni di sangue, la membrana può avere un colore leggermente marrone o giallo. Le fasi di lavaggio rimuoveranno queste impurità. Di solito ci sono due fasi di lavaggio, anche se questo varia a seconda del tipo di campione.

Il primo lavaggio prevede solitamente una bassa concentrazione di sali caotropici per rimuovere proteine e pigmenti residui. Questo è sempre seguito da un lavaggio con etanolo per rimuovere i sali. Le colonne contengono una resina di silice che lega selettivamente il DNA/RNA. Il DNA di interesse può essere isolato in virtù della sua capacità di legarsi alla silice in presenza di alte concentrazioni di sali caotropici. Questi sali vengono rimossi con un lavaggio a base di alcol e il DNA viene eluito utilizzando una soluzione a bassa forza ionica come il tampone TE o l’acqua.

Il legame del DNA alla silice sembra essere guidato dalla disidratazione e dalla formazione di legami idrogeno, che competono contro la debole repulsione elettrostatica. Pertanto, un’alta concentrazione di sale aiuterà a guidare l’adsorbimento del DNA sulla silice, e una bassa concentrazione rilascerà il DNA.

Eluizione

Il volume del tampone di eluizione e il metodo possono essere adattati all’applicazione a valle per ottenere una resa e/o una concentrazione maggiore rispetto al metodo standard. Il tampone di eluizione è usato per lavare le proteine non legate all’inizio e, ad una concentrazione più alta, rilascia la proteina desiderata dal ligando. È importante che il tampone di eluizione agisca rapidamente senza modificare la funzione o l’attività della proteina desiderata. Per la massima eluizione del DNA, lasciare che il buffer rimanga sulla membrana per alcuni minuti prima della centrifugazione. Il tampone di eluizione AE (5 mM Tris/HCl, pH 8.5) può essere sostituito da un tampone TE o da acqua. È preferibile utilizzare un tampone debolmente tamponato, leggermente alcalino che non contiene EDTA, soprattutto se il DNA plasmidico è destinato a reazioni di sequenziamento.

Analisi del gel

Si raccomanda di rimuovere e salvare delle aliquote durante la procedura di purificazione.

Se il DNA plasmidico è di bassa resa o di scarsa qualità, i campioni possono essere analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio per determinare in quale fase della procedura di purificazione si è verificato il problema.

Procedura

Raccogliere le cellule batteriche e risospese

1. Prelevare una singola colonia da una piastra selettiva appena stesa e inoculare una coltura starter di 2-5 ml di terreno LB contenente l’antibiotico selettivo appropriato. Incubare per circa 8 ore a 37°C con agitazione vigorosa (circa 300 rpm).

2. 2. Diluire la coltura starter da 1/500 a 1/1000 in 3 ml di terreno LB selettivo. Coltivare a 37°C per 12-16 ore con agitazione vigorosa (circa 300 rpm).

3. 3. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 6000 x g per 15 min e rimuovere quanto più possibile del surnatante. Risospendere il pellet batterico in 0,1-0,5 ml di tampone di risospensione (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml RNase A, pH 8,0). I batteri devono essere completamente risospesi con il vortex o pipettando su e giù fino a quando non rimangono grumi di cellule.

lisi cellulare

4. Aggiungere 0,25 ml di tampone di lisi, mescolare bene invertendo vigorosamente la provetta sigillata 4-6 volte, e incubare a temperatura ambiente (15-25°C) per 5 minuti. Non vortexare, in quanto ciò causerebbe il taglio del DNA genomico. Il lisato dovrebbe avere un aspetto viscoso. Non lasciare che la reazione di lisi duri più di 5 minuti.

Neutralizzazione

5. Aggiungere 0,3 ml di tampone di neutralizzazione, mescolare immediatamente e accuratamente invertendo vigorosamente 4-6 volte, e incubare in ghiaccio per 5 minuti. La precipitazione è maggiore se il tampone di neutralizzazione freddo viene utilizzato e incubato in ghiaccio. Dopo l’aggiunta del tampone di neutralizzazione, si forma un materiale bianco e soffice e il lisato diventa meno viscoso. Il materiale precipitato contiene DNA genomico, proteine, detriti cellulari e KDS. Il lisato deve essere mescolato accuratamente per garantire una precipitazione uniforme del dodecil solfato di potassio. Se la miscela appare ancora viscosa, è necessaria un’ulteriore miscelazione per neutralizzare completamente la soluzione. Una sospensione omogenea e incolore indica che l’SDS è effettivamente precipitato.

Caricare il lisato sulla colonna

6. Prima di caricare la colonna, rimuovere attentamente il surnatante e trasferirlo in una provetta di raccolta contenente la colonna e centrifugare a 13.000 rpm per 1 minuto.
7. Scartare il liquido di scorrimento e rimuovere rapidamente il surnatante contenente il DNA plasmidico. Dopo la centrifugazione, il surnatante dovrebbe essere chiaro.
8. Se il surnatante non è limpido, è necessario eseguire una seconda centrifugazione più breve per evitare l’applicazione di materiale sospeso o particolato alla colonna. Il materiale sospeso (che fa apparire il campione torbido) intasa la colonna e riduce o elimina il flusso.

Rilegatura e lavaggio

9. Aggiungere 0,7 ml di tampone di lavaggio alla colonna posta nella provetta di raccolta e centrifugare per 10 minuti a 13000 rpm per 1 minuto. 10. Equilibrare applicando 1 ml di tampone di equilibrio (750 mM NaCl, 50 Mm MOPS, ph 7.0, 15 % isopropanolo) e lasciare che la colonna si svuoti per gravità. Il flusso del tampone inizierà automaticamente per la riduzione della tensione superficiale dovuta alla presenza del detergente nel tampone di equilibrio.
10. 10. Applicare il surnatante del punto 6 alla colonna e lasciarlo entrare nella resina per gravità.

Eluizione del plasmide

11. Eluire il DNA con 0,8 ml di tampone di eluizione (1,23 M NAcL, 50 mm Tris-Cl, pH 8,5, 15%v isopropanolo) Raccogliere l’eluato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml o 2 ml.
12. Precipitare il DNA aggiungendo 0,7 volumi (0,56 ml per 0,8 ml di volume di eluizione) di isopropanolo a temperatura ambiente al DNA eluito. Mescolare e centrifugare immediatamente a ≥ 10.000 rpm per 30 min in una microcentrifuga. Decantare con cura il surnatante. Tutte le soluzioni dovrebbero essere a temperatura ambiente per ridurre al minimo la precipitazione di sale.
13. Lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 rpm per 10 min.
14. Decantare con cura il surnatante senza disturbare il pellet.
15. L’etanolo al 70% rimuove il sale precipitato e sostituisce l’isopropanolo con il più volatile etanolo, che facilita la ridissoluzione del DNA.
16. Asciugare all’aria il pellet per 5-10 minuti e ridissolvere il DNA in un volume appropriato di tampone (ad es. tampone TE, pH 8.0, o Tris-Cl 10mM, pH 8.5). Ridisciogliere il pellet di DNA risciacquando le pareti per recuperare tutto il DNA.

Determinazione delle prestazioni

To determine the yield, the DNA concentration should be determined both by UV spectrophotometry at 260 nm and by quantitative analysis on an agarose gel. To quantify the nucleic acid concentration, dilute the plasmid DNA 1 : 100 or 1 : 50 (depending on the plasmid copy number) in TE buffer and measure the absorbance (optical density) at 260 nm (A260) and 280 nm (A280). Use the TE buffer as a blank. This measurement allows direct calculation of the nucleic acid concentration using the formula

[DNA] (μg/mL) = A260 × Dilution factor × 50

where 50 is the extinction coefficient of DNA. The ratio A260/A280 provides a reasonable estimate of the purity of the preparation.

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