In questo articolo, per maggiore chiarezza, discuteremo le differenze tra qPCR e dPCR. L’amplificazione del DNA mediante PCR è oggi una tecnica di laboratorio fondamentale e le innovazioni continuano ad ampliarne l’uso nei laboratori di ricerca e nelle cliniche. La PCR quantitativa (qPCR) consente una quantificazione relativa del DNA bersaglio ed è un metodo affidabile e consolidato per verificare la presenza o l’assenza di determinate sequenze (ad esempio, la maggior parte dei test basati sulla PCR per il coronavirus utilizza la qPCR). Un’altra forma di PCR, la PCR digitale (dPCR) o PCR digitale a gocce (ddPCR), utilizza una chimica simile per rilevare le sequenze di DNA.
Che cos’è la PCR in tempo reale (qPCR)?
La PCR in tempo reale o quantitativa (qPCR) utilizza molecole reporter fluorescenti per quantificare i prodotti amplificati. Come nella PCR convenzionale, viene amplificato un modello di DNA, cDNA o RNA, ma a ogni ciclo i segnali fluorescenti vengono monitorati per una quantificazione relativa o assoluta. Questa tecnica è utile per molte aree di ricerca, come l’analisi dell’espressione genica, la genotipizzazione, l’analisi dei microRNA, l’analisi delle variazioni genetiche e l’analisi delle proteine.
Che cos’è la PCR digitale (dPCR)?
La PCR digitale (dPCR) sta diventando la tecnologia complementare alla PCR in tempo reale per la quantificazione accurata degli acidi nucleici, in quanto è in grado di offrire un’elevata sensibilità e prestazioni robuste contro gli inibitori. La PCR digitale riunisce un’ampia gamma di applicazioni di ricerca, offrendo un’affidabilità senza pari per la quantificazione di target rari, variazioni del numero di copie (CNV), espressione genica e altro ancora.
- Quantificazione di geni con bassa abbondanza o piccole differenze
- Quantificazione assoluta
- Variazione del numero di copie del gene (CNV)
- Determinazione del numero di copie del vettore (CNV) e rilevamento di retrovirus competenti per la replicazione (RCR) o lentivirus (LCL) nel contesto della terapia cellulare adottiva
- Rilevamento di eventi rari, come le mutazioni dei geni del cancro nei tessuti o nelle biopsie liquide.
Differenze tra qPCR e dPCR
La qPCR è un metodo frequentemente utilizzato per lo screening di grandi popolazioni di cellule e può fornire una rapida genotipizzazione mediante HRM. La dPCR è consigliata per l’analisi della variazione del numero di copie, in quanto può rilevare accuratamente la variazione di copie con un numero inferiore di repliche rispetto alla qPCR.
Vantaggi qPCR
- Ampio intervallo di rilevamento dinamico
- Basso costo sperimentale per campione
- Elevata produzione di campioni
Vantaggi dPCR
- Nessuna dipendenza da curve standard e campioni di riferimento
- Elevata tolleranza agli inibitori biologici e alla preparazione dei campioni
- Migliori prestazioni per le applicazioni che richiedono maggiore sensibilità e precisione
Quando è necessario rilevare eventi rari
Un’applicazione particolarmente valida per la dPCR è il rilevamento di eventi rari negli studi clinici. Biocompare ha parlato con Gary Lee, scienziato senior di Sangamo, Inc. dell’adozione della dPCR da parte dell’azienda alla fine del 2011. Sangamo è specializzata nella terapia genica e progetta nucleasi che legano il DNA alla proteina zinc finger (ZFP), consentendo di personalizzare l’espressione genica. Una di queste terapie, attualmente in due studi clinici di Fase II, potrebbe un giorno fornire una cura funzionale per l’HIV, offrendo un’alternativa ai trattamenti farmacologici convenzionali.
RT-PCR o qPCR
I progressi della biotecnologia hanno portato alla scoperta di vari modi per soddisfare la domanda di trapianti di organi nel corso degli anni. In passato, una persona che donava volontariamente un organo subito dopo la morte a un paziente bisognoso poteva solo attivare l’operazione di trapianto. I continui studi e ricerche dei biologi hanno portato alla scoperta delle cellule staminali.
Le cellule staminali sono cellule estratte dal DNA di un embrione, che serviranno come fonte per la rigenerazione di cellule che saranno essenzialmente un clone dell’organo da cui è stato estratto il DNA. Sebbene gli attivisti per i diritti umani chiedano la fine di queste procedure, le operazioni di successo hanno dimostrato l’efficacia dei progressi delle cellule staminali nel trapianto di organi.
Tuttavia, prima di poter apprezzare e comprendere appieno le cellule staminali, è necessario familiarizzare con le diverse terminologie associate a questa scoperta scientifica. La cultura delle cellule staminali riguarda il DNA e la sua codifica. È quindi fondamentale per gli studenti o per chiunque sia interessato a questo campo fare la distinzione tra RT-PCR e qPCR.
