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CRISPR | Gentaur

L’acronimo CRISPR indica sequenze ripetitive nel DNA dei batteri, che funzionano come autovaccini.
Molte malattie umane sono di natura genetica, causate da cambiamenti o mutazioni nella sequenza genetica di un individuo o dall’espressione aberrante di alcuni geni. La terapia genica mira a correggere o sostituire il gene disfunzionale in una cellula e il primo studio clinico di successo nel 1990 ha dato a molti pazienti la speranza di un possibile trattamento quando le opzioni precedenti erano limitate o inesistenti.1 Tuttavia, la terapia genica ha subito alcune importanti battute d’arresto: una reazione immunitaria al sistema di somministrazione virale ha causato la morte di un paziente in uno studio clinico e diversi pazienti hanno sviluppato la leucemia a causa dell’inserimento di un gene in un locus oncogeno. Questi tragici eventi hanno sollevato notevoli preoccupazioni per la sicurezza e le sperimentazioni cliniche di terapia genica sono state interrotte per oltre un decennio.

Che cos’è il “CRISPR”?

La CRISPR è una tecnologia che può essere utilizzata per modificare i geni e, come tale, ha il potenziale per cambiare il mondo.
L’essenza di CRISPR è semplice: è un modo per trovare un pezzo specifico di DNA in una cellula. Il passo successivo nell’editing genico CRISPR è di solito quello di modificare quel pezzo di DNA. Tuttavia, la CRISPR è stata adattata anche per fare altre cose, come accendere o spegnere geni senza modificarne la sequenza.

Che cos’è il CRISPR-Cas9?

CRISPR-Cas9 è uno strumento di editing del genoma che sta conquistando il mondo scientifico. È più veloce, più economico e più preciso delle precedenti tecniche di editing del DNA e ha un’ampia gamma di potenziali applicazioni.
CRISPR-Cas9 è una tecnologia unica che consente a genetisti e ricercatori medici di modificare parti del genoma eliminando, aggiungendo o alterando sezioni della sequenza del DNA.
Attualmente è il metodo più semplice, versatile e accurato di manipolazione genetica e sta quindi suscitando grande interesse nel mondo scientifico.
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Terapia cellulare e genica con CRISPR

La terapia genica mira a trattare le malattie introducendo materiale genetico per correggere una mutazione o fornire una copia funzionale di un gene. Le modifiche possono essere in vivo, direttamente all’interno del corpo umano, o ex vivo, all’esterno del corpo. Un altro approccio è la terapia cellulare, che prevede l’introduzione di cellule intere nel paziente, utilizzando cellule derivate dal paziente stesso o da donatori sani. Nelle applicazioni di ricerca, CRISPR-Cas9 ha superato le precedenti tecnologie di editing genico grazie alla sua intrinseca efficienza e semplicità: invece di richiedere un’ingegneria proteica costosa e lunga, le modifiche alle sequenze genomiche possono essere apportate con una porzione di 20 nucleotidi di un singolo RNA guida (sgRNA). È in corso un intenso lavoro per portare questa stessa potenza alle applicazioni cliniche.

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Superare i limiti di CRISPR

Pur essendo un approccio promettente alla terapia cellulare e genica, la CRISPR presenta diverse limitazioni, tra cui l’attività fuori bersaglio e l’editing inefficace dei danni al DNA, la consegna e la tossicità, ma il rapido progresso della tecnologia CRISPR significa che sono già state sviluppate diverse strategie per aggirarle:

Modificare Cas9 per ridurre l’attività fuori bersaglio: Una delle principali preoccupazioni di CRISPR è l’attività fuori bersaglio, cioè l’introduzione di una modifica in un punto inaspettato. Un approccio per ridurre l’attività fuori bersaglio consiste nell’utilizzare una Cas9 “nickasi” modificata che può introdurre solo una singola linea di modifica con le varianti nickasi, richiedendo quindi una coppia di sgRNA di compensazione per introdurre una doppia linea di interruzione, il che diminuisce la probabilità che ciò si verifichi in siti fuori bersaglio.8 In alternativa, è possibile alterare l’energia di legame al DNA di Cas9, creando varianti di Cas9 ad alta fedeltà come SpCas9-HF, SpCas9-NG, evoCas9 e Cas9_R63A/Q768A. Queste varianti di Cas9 ingegnerizzate hanno una minore capacità di modificare i siti non corrispondenti, migliorando così in modo significativo la specificità del bersaglio e mantenendo il clivaggio del bersaglio.

Design ottimale della guida: Ci sono diversi elementi dell’sgRNA che possono influenzare la specificità, come la sequenza seme di 10-12 bp, il contenuto di GC e i troncamenti all’estremità 5′, e non tutti gli sgRNA producono un editing efficiente e specifico. Gli scienziati hanno sviluppato piattaforme computazionali in grado di fornire sequenze guida ottimizzate rispetto al gene di interesse, come E-Crisp, CRISPR-Design e CasOFFinder, che utilizzano algoritmi generati da dati di screening fenotipico. Più recentemente, sgDesigner ha utilizzato una libreria di plasmidi al silicio per generare dati sull’efficienza di editing, anziché basarsi sui risultati variabili dello screening fenotipico. Lo strumento sgDesigner ha superato gli strumenti precedenti e promette di essere una piattaforma più robusta per la progettazione di guide.

Miglioramento del targeting con proteine Cas alternative: Cas9 di S. pyogenes è la proteina Cas9 più comunemente utilizzata, che riconosce il sito 3′-NGG’5′ Protospacer Adjacent Motif (PAM). Tuttavia, le sue grandi dimensioni ne rendono difficile il confezionamento in vettori AAV per la somministrazione di terapie geniche. Le alternative Cas9 più piccole, come S. aureus Cas9 (SaCas9), richiedono un PAM più lungo, che riduce il numero di siti bersaglio disponibili per la terapia genica e cellulare. Le varianti Sp-Cas9-NG e xCas9 sono state progettate per essere più piccole con un elevato requisito di MAP.12,13 Ma la nuova variante SpRY di Cas9 è stata sviluppata per riconoscere NRN > NYN, quindi non ha praticamente alcun requisito di MAP e offre la possibilità di modificare qualsiasi sito nel genoma.14 Sono state sviluppate anche varianti di Cas9 a bersaglio di RNA, tra cui SpyCas9 e Cas13d, che possono offrire l’editing genico senza introdurre una doppia rottura.

Ridurre la tossicità del danno al DNA con gli editor di basi e nuclei: I tassi di efficienza dell’editing per la ricombinazione omologa (HDR) sono bassi, spesso soggetti a errori e l’introduzione di una doppia rottura nel DNA può indurre l’apoptosi delle cellule, un problema di sicurezza significativo per le applicazioni cliniche. Un recente progresso è stato lo sviluppo della tecnologia di editing delle basi, che utilizza una nickasi Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) legata a una deaminasi per facilitare l’editing di un singolo nucleotide senza indurre danni tossici al DNA. Più recentemente, è stato sviluppato l’editing primario, in cui una nickasi Cas9 è coniugata a una trascrittasi inversa – insieme a un RNA guida per l’editing primario (pRNA) contenente la modifica richiesta – il sistema di editing primario può “cercare e sostituire” le modifiche desiderate, fornendo così un editing genico di precisione con un’attività fuori bersaglio significativamente ridotta.

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TERAPIA CRISPR: evitare il collo di bottiglia degli sgRNA GMP

Ma portare CRISPR in clinica è costoso e richiede tempo: il trattamento della malattia falciforme costa fino a 2 milioni di dollari per un singolo paziente. Nella fase di scoperta preclinica, i reagenti CRISPR utilizzati saranno solo per scopi di ricerca (RUO). La disponibilità, la flessibilità e l’accessibilità degli sgRNA per la ricerca consentono alla ricerca di essere agile e di muoversi rapidamente per stabilire la proof-of-concept delle terapie basate su CRISPR. Ma il passaggio alla clinica richiede lo sviluppo e l’implementazione di reagenti di qualità GMP (Good Manufacturing Practice) per garantire la tracciabilità, la sicurezza, la purezza e l’efficacia di questi prodotti. La transizione da RUO a GMP sgRNA può essere complicata e, senza un’adeguata pianificazione, il passaggio dalla scoperta allo sviluppo del processo può essere accompagnato da notevoli colli di bottiglia. Un buon modo per garantire una transizione senza intoppi è assicurarsi che i fornitori di reagenti CRISPR abbiano la capacità e l’esperienza per produrre reagenti di qualità GMP.

Il futuro delle terapie CRISPR è qui

Dall’articolo fondamentale di Doudna e Charpentier di oltre dieci anni fa, CRISPR ha rivoluzionato l’editing genico e offre interessanti possibilità per la terapia cellulare e genica. CRISPR può essere utilizzato per modificare le sequenze di DNA in vivo ed ex vivo per trattare una serie di malattie genetiche, nonché per modificare le cellule per ripararle o migliorarne la funzione, ad esempio modificando le cellule T per aumentarne l’efficacia nella lotta contro il cancro. Ci sono ancora dei limiti, ma lo sviluppo esponenziale della tecnologia sta consentendo soluzioni di attenuazione rapida, offrendo un potenziale trattamento per molte malattie umane.

Punti chiave da ricordare

  • Le tecnologie di editing genico, come CRISPR-Cas9, sono molto promettenti per le applicazioni cliniche perché le modifiche genetiche possono essere eseguite in situ, evitando l’aggiunta di materiale genetico in siti potenzialmente indesiderati del genoma.
  • Le terapie basate su CRISPR svolgono un ruolo in diversi studi di terapia genica e cellulare attualmente in corso in varie aree terapeutiche.
  • La tecnologia CRISPR-Cas9 presenta ancora dei limiti, ma i rapidi progressi della tecnologia CRISPR fanno sì che siano già state sviluppate diverse soluzioni di mitigazione, tra cui proteine Cas9 modificate per ridurre l’attività fuori bersaglio, strumenti di progettazione per selezionare gli sgRNA ottimali ed editor nucleari e primari per ridurre la tossicità del danno al DNA.
  • L’introduzione di CRISPR nella clinica richiede il passaggio da reagenti per la sola ricerca (RUO) a reagenti di qualità GMP (good manufacturing practice), il che può essere complicato. Ma la collaborazione con fornitori affermati ed esperti può rendere la transizione agevole.
Fonti :
  1. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer
  2. Gentaur
  3. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia