Complementary DNA cDNA

Complementary DNA (cDNA)

Il DNA complementare (cDNA) è un DNA a doppio filamento modello di una molecola di mRNA. Negli eucarioti superiori, un mRNA è un predittore più utile di una sequenza polipeptidica che una sequenza genomica, perché gli introni sono stati giuntati insieme. I ricercatori preferiscono usare il cDNA piuttosto che l’mRNA stesso perché gli RNA sono intrinsecamente meno stabili del DNA e non ci sono tecniche per amplificare e purificare di routine le singole molecole di RNA.

Il DNA complementare è realizzato a partire dall’mRNA con l’uso di un enzima unico noto come trascrittasi opposta, inizialmente rimosso dai retrovirus. Usando una molecola di mRNA come modello, la trascrittasi inversa sintetizza una molecola di DNA a singolo filamento che può essere usata come modello per la sintesi del DNA a doppio filamento.

Cos’è il cDNA?

Il DNA complementare è una copia del DNA che può provenire da procarioti o eucarioti. Viene utilizzato nell’ingegneria genetica per fornire cloni di diversi geni. Il cDNA viene sintetizzato dall’mRNA da un enzima chiamato trascrittasi inversa.

cDNA Synthesis

Nella vita cellulare, il DNA complementare è generato attraverso virus e retrotrasposoni per l’integrazione dell’RNA nel DNA genomico dell’obiettivo. In biologia molecolare, l’RNA viene purificato dal tessuto iniziale dopo l’eliminazione del DNA genomico, delle proteine e dei diversi componenti cellulari.

La sintesi del DNA complementare dall’RNA è un primo passo vitale in molte applicazioni molecolari. L’analisi dell’espressione genica, l’individuazione di patogeni e i test genetici tramite PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) o sequenziamento di prossima generazione (NGS) sono solo alcuni esempi di applicazioni che richiedono la trascrizione dell’RNA in cDNA come passo iniziale.

Ottenere risultati accurati e precisi con queste applicazioni richiede una sintesi di cDNA ad alta fedeltà in modo che la libreria di cDNA rappresenti accuratamente le trascrizioni originali di RNA.Due preoccupazioni critiche nel decidere un pacchetto di sintesi di cDNA sono l’enzima di trascrittasi opposta e l’approccio di priming utilizzato per provocare la reazione. La scelta dell’enzima influenza la velocità di sintesi e la fedeltà della reazione. Le strategie di adescamento influenzano ciò che viene trascritto nella reazione e, se subottimale, può risultare in una libreria distorta che non rappresenta accuratamente l’intero trascrittoma.

Cos'è il kit di sintesi del cDNA?

I kit di sintesi cDNA offrono un modo rapido e affidabile di produrre cDNA da campioni di RNA. Questi kit comodi e pronti all’uso includono i componenti necessari per la trascrizione inversa, la trascrittasi inversa (RT), i dNTP, il tampone di reazione, l’acqua priva di nucleasi e gli inibitori della RNasi. I protocolli ottimizzati e i reagenti di alta qualità forniti possono aiutare a risolvere rese di cDNA insoddisfacenti dovute a una bassa concentrazione di RNA, alla complessità del gene target o a incongruenze dei reagenti.
Per preparare la reazione, di solito sono inclusi oligo(dT) o esameri casuali (o entrambi). Quando si sceglie un kit di sintesi cDNA, considerare la dimensione del frammento trascritto, la compatibilità con le applicazioni a valle e il numero di reazioni per kit.