Coltura e mantenimento delle cellule staminali

Coltura e mantenimento delle cellule staminali

Le cellule staminali – provenienti da donatori sani o da pazienti – sono spesso utilizzate nella ricerca di base, nella scoperta di farmaci e nelle applicazioni terapeutiche, ma la loro coltivazione può essere difficile. Questo articolo fornisce suggerimenti su come coltivare le cellule staminali in laboratorio per garantire risultati riproducibili e affidabili.
Nelle giuste condizioni, le cellule staminali mantengono il loro stato di cellule staminali (auto-rinnovamento) o si differenziano lungo un percorso specifico. Queste cellule provengono da fonti che vanno dall’embrione al tessuto connettivo, oppure possono essere create de-differenziando lignaggi già impegnati.
Ai fini pratici, la maggior parte delle cellule staminali può essere suddivisa in due tipi: cellule staminali adulte e cellule staminali pluripotenti (PSC), osserva James Chen, CEO di ScienCell. Quest’ultima categoria comprende le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC): “Queste cellule utilizzano fondamentalmente le stesse condizioni di coltura”, spiega Chen.

Nutrirmi : Coltura delle cellule staminali

“La coltura delle cellule staminali è un’arte e siamo ancora agli inizi”, osserva Lindy O’Clair, BioAnalytics Reagents and Consumables Manager, Product Management BioAnalytics Workflows, Sartorius. “È importante considerare la qualità del materiale di partenza. La comprensione dei reagenti e del loro impatto sulla vitalità e sulla riproducibilità delle colture cellulari, nonché la coltivazione in apparecchiature affidabili, consentono di ottenere dati affidabili e riproducibili.”
Storicamente, le PSC venivano coltivate su uno strato di cellule di alimentazione, di solito fibroblasti mitoticamente inattivati, una tecnica utilizzata ancora oggi. Queste cellule di alimentazione non solo fornivano una matrice di supporto fisico, ma condizionavano anche il terreno di coltura con fattori di crescita (talvolta non identificati) necessari per lo sviluppo delle cellule staminali e il loro mantenimento in uno stato indifferenziato. Oltre ai problemi di riproducibilità, il sistema delle cellule alimentatrici presenta alcuni svantaggi, tra cui il fatto che richiede molta manodopera e che la superficie di alimentazione deve essere preparata in anticipo. Può dare origine a colture miste che possono essere difficili da separare. Inoltre, nel caso di alimentazione interspecie (fibroblasti di topo con PSC umane, per esempio), esiste il rischio di trasmissione di agenti patogeni.
Le colture senza alimentazione sono più facili e meno lunghe da allestire e mantenere, più riproducibili, più facilmente scalabili e non soffrono delle possibili insidie delle co-colture.
Tuttavia, in assenza di uno strato di cellule nutrici, le PSC non aderiscono alle comuni superfici di coltura tissutale. Un’ampia gamma di matrici, di solito derivate o imitanti le proteine della matrice extracellulare (ECM), da sole o in combinazione, sono utilizzate come supporti fisici, sia per colture (relativamente) piane che per colture più tridimensionali. I ricercatori possono rivestire da soli le piastre di coltura utilizzando la matrice di loro scelta alla diluizione desiderata, a seconda del protocollo che stanno seguendo, oppure acquistare piastre di coltura pre-rivestite.
Coltura cellule staminali
In assenza di cellule feeder, il terreno condizionato è stato sostituito da un terreno definito per le cellule staminali, basato sul lavoro pionieristico di James Thomson dell’Università del Wisconsin. Diverse aziende offrono oggi terreni commerciali simili per la coltivazione delle PSC, spiega Chen: Si tratta fondamentalmente di DMEM/F12 e di integratori”, il principale dei quali è il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF).

Coltivazione di iPSC

Sebbene esistano alcuni fornitori selezionati da cui ottenere le iPSC, la maggior parte delle persone isola le proprie – ci sono molti buoni protocolli facilmente disponibili da colleghi e online, commenta Chen.
Le linee cellulari ottenute possono variare l’una dall’altra a seconda di una serie di fattori, secondo la guida dell’ATCC alla coltura delle cellule staminali: Tips and Techniques for Stem Cell Cultures. Questi includono la genetica, l’impronta genomica e le condizioni di coltura, nonché il metodo utilizzato per de-differenziare (riprogrammare) le cellule riportandole allo stato pluripotente.
Esistono tuttavia metodi quasi universali per la cura delle PSC.

Alcuni consigli sulle cellule staminali

Le colture devono essere esaminate quotidianamente. In particolare, si devono osservare i cambiamenti morfologici, che possono significare che le cellule si stanno differenziando – meno del 10% delle cellule dovrebbe differenziarsi. Le PSC indifferenziate si sviluppano come colonie compatte, con un elevato rapporto nucleo/citoplasma e nuclei prominenti. Le piccole colonie possono inizialmente apparire allentate, ma diventano più strette man mano che crescono. Poiché le colonie tendono a impilarsi e a sovrapporsi durante la crescita, il loro centro tende ad apparire luminoso.
Le cellule che mostrano segni di differenziazione e quelle che non sono attaccate devono essere rimosse: un buon modo per farlo è marcare l’area e aspirarle usando un puntale da 200 microlitri all’estremità di una pipetta aspirante.
Il terreno di coltura deve essere cambiato completamente ogni giorno o due (a seconda di chi lo chiede).
Monitorare la confluenza. Le cellule devono essere trasferite quando raggiungono circa l’80% di confluenza o dopo circa cinque giorni. Maneggiare le colture con cura, utilizzando un metodo privo di enzimi (con un agente chelante come EDTA o EGTA) o una soluzione enzimatica leggera come Accutase per rimuovere le cellule dalla piastra. Assicurarsi che le cellule rimangano raggruppate (con minori probabilità di differenziazione) e ridurre al minimo il pipettaggio delle cellule durante il passaggio. L’inibitore ROCK deve essere usato quando le cellule si riprendono dal passaggio o dallo scongelamento (ma non è necessario durante i semplici cambi di terreno).
Durante il passaggio, le cellule devono essere divise in un rapporto 1:4 e congelate in grumi utilizzando un mezzo di congelamento per cellule staminali a una velocità di un grado al minuto.
cellule staminali

Know what you have

Morphology can vary depending on culture conditions and cell condition. Many researchers rely on pluripotency marker panels to check the status of their cells, O’Clair points out – a time-consuming and expensive process that requires the sacrifice of cells (functional assays in which stem cells are induced to differentiate into more compromised phenotypes are even more so). She “looks forward to the advent of technology that can accurately identify and assess the state of stem cell culture”.

“Other” stem cells

Adult stem cells – self-renewing but uncommitted multipotent cells isolated from somatic tissue – are an attractive alternative to PSCs, points out John Ludlow, Zen-Bio’s vice president of regenerative medicine. The raw material can be essentially unlimited, and their culture is often far less delicate – often in ordinary tissue culture material, using commercially available standard culture media and growth factors contained in fetal bovine serum. Depending on the source, they can be differentiated – partially or fully – through selected pathways into, for example, adipocytes or neurocytes, monocytes or hepatocytes.

‘Adult stem cells and their progeny can be used to generate materials such as enzymes, for example,’ says Ludlow. ‘They can be used for functional assays, and agonised or antagonised pharmacologically to modulate that function. They can be migrated across membranes or used in animal studies to examine their toxicity profile.

Stem cells, of any variety – pluripotent, adult, even cancerous, or those yet to be discovered – will inevitably be exploited for a multitude of applications ranging from a better understanding of basic biology, health and disease, to alleviating or curing disease. Growing and maintaining these cells, while an art, is not rocket science.

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